微生物次级代谢产物是抗生素、降胆固醇药物、抗肿瘤制剂等药用分子的重要来源之一,其中不乏结构新颖独特的化合物。这类天然产物的生物合成过程中会涉及到许多功能新颖的生物合成酶,研究这些酶的结构和催化机制,对阐述天然产物的生物合成途径、构建具有更高临床应用价值的天然产物的结构类似物有着重大意义。本篇论文包括两个部分,第一部分内容是腺苷酸化酶KstB1结构和功能的初步研究。越野他汀作为具有良好的抗肿瘤活性的蒽环类天然产物,其结构中的吡咯环是关键的药效基团。我们的合作方唐功利课题组通过前期工作确定了腺苷酸化酶KstB1参与到了吡咯环中间体的生物合成。早期认为KstB1识别并催化的底物是烟酸,但生化实验数据并不支持这一猜想;后期实验确定了氨基吡咯酸中间体AT是KstB1催化腺苷酸化反应的底物。为了说明KstB1特异性识别底物AT的催化机制,从结构角度研究KstB1与底物AT的结合模式,并阐明KstB1在识别AT和烟酸过程中不同之处,我们首先将质粒转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,纯化制备了大量的可溶性蛋白,配制成一定浓度的蛋白样品进行晶体筛选,利用X-Ray单晶衍射技术,在上海同步辐射光源收取到了一套2.2?的衍射数据。但KstB1与目前已有结构蛋白的序列相似性过低,无法确定相位信息,因此不能通过分子置换法来确定蛋白的最终结构,只能通过软件模拟得到蛋白的结构模型,目前工作还在筛选硒代蛋白晶体阶段。第二部分工作围绕过氧化酶FtmOx1展开。含有过氧桥键的化合物青蒿素曾作为一线抗疟疾药物挽救了无数人的生命,而有关于过氧键合酶的报道却很少。研究人员通过大量的研究筛选,从几株霉菌和青霉菌中分离得到了一种含有过氧桥键、具有抗感染活性的生物碱疣孢青霉原(Verruculogen),其中的过氧桥键是由过氧化酶FtmOx1通过催化烟曲霉毒素(Fumitremorgin B)发生过氧化反应而生成的。截止目前,有两种不同的反应机理来解释FtmOx1的催化过程。另外,实验室成员在研究催化机理过程中,发现T134残基可能起到控制反应方向的作用。为了探究FtmOx1的催化机制,我们期望能通过X-Ray单晶衍射或者核磁共振技术探究溶液状态下FtmOx1与底物分子的结合状态。我们将质粒转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,制备了纯度高、均一性好的可溶性蛋白,进行蛋白晶体的筛选,在上海光源收取到两套完整性良好的衍射数据,但没有观察到底物分子的电子云密度。为了增加底物分子进入蛋白活性口袋的可能性,我们对质粒进行了改造,虽然没有得到复合物晶体,但这些数据仍为阐明FtmOx1的反应机制奠定了一定的基础,有着一定的参考价值。