目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率高,在世界范围内,占恶性肿瘤死亡原因的第二位,危害极大。近几十年来,世界许多地区和国家如北美、欧洲、亚洲,胃癌发生部位出现了显著变化,胃远端(胃窦部)胃癌发生率明显下降,而贲门癌和食管末端腺癌的发病率明显升高。我国也出现了相同的变化趋势,但仍不清楚出现此种变化的原因。目前,对胃癌和食管癌的研究较多,但国内外文献对贲门癌报道甚少,贲门癌的组织发生及癌变机制尚不清楚。与远端胃癌相比,贲门癌具有更高的侵袭性,不同的免疫组化表型及病因流行病学特征,贲门癌可能是胃癌中的一种特殊亚型。mTOR/4E-BP1信号通路是在过去十年中发现的有重要临床意义的分子信号通路,其在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用,它所介导的信号传导通路的异常与多种恶性肿瘤有关。mTOR(mammalian target of rapamycin)是雷帕霉素(rapamycin)靶分子,是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用。真核翻译起始因子4E-结合蛋白1(eIF4E-binding protein1, 4E-BP1 )是mTOR的第一个下游底物,是一种小分子蛋白,它可以抑制与真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)相关的翻译启动。eIF4E是一种原癌基因,其编码的eIF4E多肽为帽结合蛋白,是最重要的真核细胞翻译起始因子,能特异地识别真核细胞mRNA 5’端的7甲基鸟苷酸帽结构m7 GPPPN并启动mRNA的翻译,是真核细胞起始翻译的重要调控点。非磷酸化的4E-BP1与eIF4E有很高的亲和力,通过和eIF4E的mRNA帽结合亚单位的结合而抑制翻译起始。在生长因子、激素或细胞内外其它刺激的作用下,mTOR被激活,活化的mTOR磷酸化其下游的4E-BP1,磷酸化的4E-BP1与eIF4E亲和力下降,使eIF4E与其解离,促使翻译起始复合物的形成,从而加速蛋白质的合成。相反,当生长因子或营养素缺乏,或者有mTOR抑制物存在时,4EBP1去磷酸化,并与eIF4E结合从而抑制翻译起始。mTOR信号通路在某些肿瘤中极度活跃,已成为肿瘤治疗的新靶点。研究发现,胃癌中存在mTOR信号通路的激活和mTOR的过表达,特别是mTOR的活化形式:p-mTOR水平的升高。依维莫司是mTOR活化的抑制剂,其在胃癌患者中已进行了多中心Ⅱ期临床研究,疗效显著,患者的总体耐受性良好,并且全球性的Ⅲ期临床研究正在筹备中,这为胃癌的靶向治疗提供了广阔的发展前景,mTOR信号通路成为胃癌治疗的新靶点。但mTOR信号通路在不同部位胃癌中的作用尚未见报导。本实验拟研究mTOR/4E-BP1信号通路在贲门腺癌发生中的作用,以进一步揭示贲门腺癌的发生、发展机制,并为贲门腺癌的治疗提供新的思路。方法:1标本收集选取手术切除贲门腺癌标本33例,癌组织取肿瘤中无出血坏死区域,正常胃粘膜组织取距离肿瘤边缘5cm以上的正常胃体粘膜,所有组织均在手术切除后迅速取材,置于液氮中,-80℃保存,所有标本均经病理证实分别为富含肿瘤细胞的贲门腺癌组织和正常胃粘膜组织。全部病例均为首发,术前均未接受放化疗。同时收集研究病例的临床病理资料。2蛋白免疫印迹(Western Blot)检测蛋白的表达2.1组织总蛋白的提取和定量将预冷的总蛋白裂解液加入组织中,以提取总蛋白。用紫外分光光度计进行定量。2.2 Western Blot方法应用Western Blot方法,检测贲门腺癌与相应正常胃粘膜组织中mTOR、4E-BP1、eIF4E的表达及mTOR、4E-BP1、eIF4E的磷酸化水平。3反转录PCR (RT-PCR)检测mRNA的表达3.1组织总RNA的提取、鉴定及定量采用异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA。1%琼脂糖电泳鉴定其完整性。紫外分光光度计进行定量。3.2 RT-PCR方法应用RT-PCR方法检测贲门腺癌与相应正常胃粘膜组织中mTOR、4E-BP1、eIF4E mRNA的表达。采用凝胶分析软件(BIO-LD)对凝胶进行定量,各组以目的基因与内参照基因GAPDH量的比值表示目的基因相对表达量。4统计采用SPSS13.0软件,数据进行配对t检验、成组t检验及相关分析。结果:1贲门腺癌与正常胃粘膜组织mTOR、4E-BP1、eIF4E在蛋白水平上的表达及mTOR、4E-BP1、eIF4E的磷酸化水平1.1 mTOR蛋白在贲门腺癌与正常胃粘膜组织的表达1.1.1蛋白免疫印迹检测mTOR蛋白的表达mTOR蛋白分子量为289KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,在289KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,癌组织mTOR蛋白的光密度值为0.296±0.08,而正常胃粘膜组织为1.348±0.36,统计学处理结果表明,与正常对照组相比,癌组织mTOR蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。1.1.2贲门腺癌mTOR蛋白表达的临床病理意义贲门腺癌mTOR蛋白的表达与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、浸润深度及淋巴结转移均无相关关系。1.2贲门腺癌与正常胃粘膜组织mTOR的磷酸化水平1.2.1 mTOR磷酸化水平的蛋白免疫印迹检测结果磷酸化型mTOR蛋白分子量为289KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,在289KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,贲门腺癌组织磷酸化型mTOR的光密度值为0.348±0.09,而正常胃粘膜组织为0.475±0.11,统计学处理结果表明,两者没有明显差异(P>0.05)。但与相应mTOR蛋白表达水平比较可见,贲门腺癌组织p-mTOR/mTOR明显高于正常胃粘膜组织(1.152±0.32 vs 0.292±0.07,P<0.05),说明贲门腺癌组织mTOR磷酸化水平明显增高。1.2.2贲门腺癌p-mTOR/mTOR的临床病理意义贲门腺癌p-mTOR/mTOR与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、浸润深度及淋巴结转移均无相关关系(P>0.05)。1.3 4E-BP1蛋白在贲门腺癌与正常胃粘膜组织的表达1.3.1蛋白免疫印迹检测4E-BP1的表达水平4E-BP1的蛋白分子量为15KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,在15KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,癌组织4E-BP1蛋白的光密度值为2.210±0.41,正常胃粘膜组织为4.498±0.76,统计学处理结果表明,与正常对照组相比,癌组织4E-BP1蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。1.3.2贲门腺癌4E-BP1蛋白表达的临床病理意义贲门腺癌4E-BP1蛋白的表达与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、浸润深度及淋巴结转移均无相关关系(P>0.05)。1.4贲门腺癌与正常胃粘膜组织4E-BP1的磷酸化水平1.4.1蛋白免疫印迹检测4E-BP1的磷酸化水平磷酸化型4E-BP1的蛋白分子量为15KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,在15KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,癌组织磷酸化型4E-BP1蛋白的光密度值为2.165±0.40,正常胃粘膜组织为1.184±0.23,统计学处理结果表明与正常对照组相比,癌组织4E-BP1蛋白的磷酸化水平明显升高(P<0.05)。1.4.2贲门腺癌4E-BP1的磷酸化水平的临床病理意义贲门腺癌4E-BP1的磷酸化水平与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、浸润深度及淋巴结转移均无相关关系(P>0.05)。1.5 eIF4E蛋白在贲门腺癌与正常胃粘膜组织的表达1.5.1蛋白免疫印迹检测eIF4E蛋白的表达eIF4E蛋白分子量为25KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,在25KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,癌组织eIF4E蛋白的光密度值为2.194±0.43,正常胃粘膜组织为2.033±0.35,统计学处理结果表明,癌组织eIF4E蛋白的表达水平与正常对照组相比没有明显差异(P>0.05)。1.5.2贲门腺癌eIF4E蛋白表达的临床病理意义贲门腺癌eIF4E蛋白的表达与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、浸润深度及淋巴结转移均无相关关系(P>0.05)。1.6贲门腺癌与正常胃粘膜组织eIF4E的磷酸化水平1.6.1蛋白免疫印迹检测eIF4E的磷酸化水平磷酸化型eIF4E蛋白分子量为25KD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,在25KD位置出现了阳性荧光条带。以β-actin(42KD)作为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,癌组织磷酸化型eIF4E蛋白的光密度值为1.822±0.55,正常胃粘膜组织为0.997±0.21,统计学处理结果表明,与正常对照组相比,癌组织eIF4E蛋白的磷酸化水平明显升高(P<0.05)。1.6.2贲门腺癌eIF4E磷酸化水平的临床病理意义贲门腺癌有淋巴结转移组磷酸化型eIF4E蛋白的光密度值为4.746±1.24,明显高于无淋巴结转移组(1.349±0.41,P<0.05)。eIF4E的磷酸化水平与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小及浸润深度均无相关关系(P>0.05)。2贲门腺癌组织和正常胃粘膜组织mTOR、4E-BP1、eIF4E mRNA的表达2.1 RT-PCR检测mTOR mRNA的表达RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳及半定量分析表明,癌组织mTOR mRNA的光密度值为3.305±0.78、正常组织为7.564±1.60,统计学处理结果表明,与正常对照组相比,癌组织mTOR mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。2.2 RT-PCR检测4E-BP1 mRNA的表达RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳及半定量分析表明,癌组织4E-BP1 mRNA的光密度值为4.388±0.40 ,正常胃粘膜组织为7.117±1.00,统计学处理结果表明,与正常对照组相比,癌组织4E-BP1 mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。2.3 RT-PCR检测eIF4E mRNA的表达RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳及半定量分析表明,癌组织eIF4E mRNA的光密度值为4.912±0.49,正常胃粘膜组织为1.095±0.01,统计学处理结果表明,与正常对照组相比,癌组织eIF4E mRNA的表达水平明显升高(P<0.05)。结论:1与正常胃粘膜组织相比,贲门腺癌组织中mTOR的表达水平明显降低,但癌组织中p-mTOR/mTOR的比值明显高于正常胃粘膜组织,提示mTOR的激活可能参与了贲门腺癌的发生,而mTOR的激活主要是通过mTOR的磷酸化而不是mTOR过表达。2贲门腺癌组织与正常胃粘膜组织相比,4E-BP1的表达水平明显降低,而4E-BP1和eIF4E的磷酸化水平明显升高,且eIF4E的磷酸化水平与淋巴结转移密切相关,提示4E-BP1和eIF4E的活化可能在贲门腺癌的发生发展过程中起重要作用3研究结果提示,mTOR/4E-BP1信号通路在贲门腺癌中被激活,mTOR/4E-BP1信号通路可能在贲门腺癌的发生发展中起一定作用,可能成为贲门腺癌治疗的靶点。