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食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前排在我国恶性肿瘤的第四位，在我国恶性肿瘤中占22.4%，每年约有25万新病人产生。食管癌的临床治疗虽有进步，5年生存率仍然较低。因此，研究与食管癌发生发展相关的信号转导通路及药物作用的靶点来寻求新的抗肿瘤药物，成为食管癌治疗研究的重点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及4E-BP1是磷脂酰肌醇3一激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol3-Kinase/proteinkinase B，P13K/PKB)信号通路的下游分子，在调节细胞生长、分化中发挥重要作用。mTOR活化后，使4E-BP1磷酸化，eIF-4E被释放并与其他翻译起始因子形成复合物，从而解除对翻译的抑制作用，导致翻译起始，加速与生长分化相关的蛋白的表达。当mTOR被抑制时，去磷酸化的4E-BP1与eIF4E结合，形成eIF4E-4EBP1复合体，抑制翻译起始。研究表明，4E-BP1的磷酸化在肿瘤的发生发展中起重要作用，因此该通路是目前研究的焦点，为临床治疗肿瘤提供新的靶点。Bufalin（蟾蜍灵）是中药蟾酥中提取的一种毒性配基，属强心甙类物质。这种成分具有抗癌、强心、抗炎、增强免疫等作用，临床上已广泛应用于治疗多种实体肿瘤、血液病和慢性乙肝等疾病。我们前期的体外实验表明：Bufalin可有效抑制食管癌细胞的生长和增殖。本实验旨在进一步探讨Bufalin在食管癌动物模型中的抗肿瘤作用，为临床应用于食管癌的治疗提供实验依据。目的:探讨Bufalin对裸鼠食管癌原位移植瘤的抑制作用及其可能诱导凋亡的机制。方法:1将36只人食管癌细胞株ECA109建立的裸鼠原位移植瘤模型随机分为模型组、Bufalin低剂量组（0.5kg/ml，BL）、中剂量组（1.0kg/ml，BM）、高剂量组（1.5kg/ml，BH）、雷帕霉素组（RAPA）、Bufalin高剂量组与雷帕霉素联合组（BR），每组6只，腹腔注射给药持续30天，用药结束后全部处死36只裸鼠，完整取出肿瘤，测量裸鼠用药前后的体重、肿瘤大小，计算肿瘤抑制率。2肿瘤组织HE染色观察肿瘤坏死程度。3RT-PCR法检测各组mTOR、4E-BP1mRNA的表达情况。4Western Blot及免疫组化法检测各组mTOR、4E-BP1、Bad、Bcl-2的蛋白水平表达及4E-BP1的活化情况。5流式细胞技术检测各组移植瘤细胞的凋亡指数。结果:1模型组、BL、BM、BH、RAPA和BR组治疗前体重为20.9±2.4g、20.8±1.5g、20.8±2.1g、20.9±2.7g、20.9±1.9g、20.8±2.1g，治疗后的体重为27.9±3.0g、28.2±1.9g、27.9±2.9g、28.1±2.8g、27.9±2.0g、27.8±2.6g，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后各组移植瘤体积分别为1.791±0.087cm3、1.720±0.088cm3、1.137±0.060cm3、0.702±0.054cm3、0.699±0.079cm3、0.506±0.076cm3，实验组肿瘤抑制率分别为4.0%、36.5%、60.8%、61.0%、71.7%，BM、BH、RAPA、BR组肿瘤体积与模型组比较缩小（P＜0.05），BR组肿瘤体积与其余各组比较缩小，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。2肿瘤组织HE染色显示：各组移植瘤内均可见坏死。模型组坏死少见；BL组以灶状坏死为主；BM组肿瘤组织内可见大片状坏死；BH、RAPA及BR组均可见大面积坏死，坏死组织内可见散在癌细胞团。3RT-PCR结果显示：模型组、BL、BM、BH、RAPA和BR组移植瘤4E-BP1mRNA表达水平分别为1.032±0.061、1.039±0.082、1.036±0.093、1.036±0.081、1.044±0.092、1.037±0.087各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组移植瘤mTOR mRNA表达水平分别为1.136±0.083、1.124±0.044、0.994±0.142、0.823±0.113、0.787±0.074、0.661±0.070，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较降低（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。4Western Blot结果显示：模型组、BL、BM、BH、RAPA和BR组移植瘤mTOR蛋白表达水平分别为1.58±0.121、1.52±0.110、1.03±0.141、0.81±0.150、0.79±0.110、0.61±0.171，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较降低（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较降低（P＜0.05）。各组移植瘤4E-BP1蛋白表达水平分别为1.205±0.143、1.320±0.131、1.310±0.142、1.217±0.133、1.315±0.134、1.214±0.121，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较降低（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较降低（P＜0.05）。各组移植瘤4E-BP1磷酸化水平分别为1.662±0.110、1.513±0.095、1.082±0.150、0.767±0.070、0.732±0.071、0.627±0.063，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较降低（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较降低（P＜0.05）。各组移植瘤Bad蛋白表达水平分别为0.610±0.054、0.695±0.055、0.818±0.151、1.037±0.123、1.056±0.105、1.180±0.160，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较升高（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较升高（P＜0.05）。各组移植瘤Bcl-2蛋白表达水平分别为1.630±0.070、1.520±0.092、1.052±0.07g、0.785±0.080、0.743±0.081、0.556±0.058，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较降低（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。肿瘤组织免疫组化反应积分（染色强度与阳性百分比乘积）结果显示：模型组、BL、BM、BH、RAPA和BR组移植瘤mTOR免疫反应积分分别为10.5±0.4、8.8±0.4g、7.3±1.0、5.0±1.1、5.0±1.1、3.0±0.6，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较减小（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较减小（P＜0.05）。各组移植瘤4E-BP1免疫反应积分分别为7.7±1.4、8.3±1.2；7.8±1.0；7.3±1.0；8.2±1.2；7.3±1.0，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组移植瘤4E-BP1的免疫反应积分分别为10.0±1.5、8.7±0.5、7.0±1.1、3.5±0.5、3.7±0.5、2.5±0.5，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较减小（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较减小（P＜0.05）。各组移植瘤Bad免疫反应积分分别为2.2±0.4、2.7±0.5、4.2±1.0、7.8±1.0、8.2±1.2、10.5±1.6，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较升高（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较升高（P＜0.05）。各组移植瘤Bcl-2免疫反应积分分别为10.0±1.5、8.8±0.4、7.0±1.1、3.7±0.5、3.7±0.5、2.7±0.5，BM、BH、RAPA、BR组表达水平与模型组比较减小（P＜0.05），BR组表达水平与其余各组比较减小，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。5PI染色法流式细胞术检测细胞凋亡结果：模型组、BL、BM、BH、RAPA及BR组移植瘤凋亡指数分别为2.58±0.16%、5.48±0.27%、11.05±1.12%、23.47±1.05%、22.29±1.20%、20.32±1.06%，实验各组凋亡指数均高于模型组（P＜0.05），以BH组凋亡指数最高，BH组凋亡指数与其余各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1Bufalin可有效抑制裸鼠人食管癌原位移植瘤的生长。2Bufalin可通过抑制mTOR/4E-BP1信号通路的活化来达到抑制肿瘤生长的效果，为Bufalin成为人食管鳞状细胞癌的分子靶向治疗药物提供了一个重要的理论依据。3Bufalin作用后的凋亡促进基因Bad的表达升高，而凋亡抑制基因Bcl-2的表达降低。提示Bufalin可通过上调Bad与下调Bcl-2的表达发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用。4Bufalin与雷帕霉素联合应用时的抗肿瘤作用较单用强，为临床联合用药提供了依据。