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水牛繁殖存在许多问题，如性成熟较晚、发情不明显、发情后期长、受胎率低等。与黄牛相比，水牛胚胎生物技术相关研究较为滞后，文献报道也相对较少。有关水牛胚胎的程序化冷冻有过成功的报道并产犊，但未见程序化冷冻水牛卵母细胞的报道。本实验旨在探索水牛生发泡(GV)期卵母细胞程序化冷冻保存的条件，希望能提高其保护效果，为水牛的IVM、IVF、核移植等生物技术提供实验材料。 本实验采用程序化冷冻方法，对不同植冰温度(-5.5℃、-6℃、-6.5℃、-7℃)下几种冷冻液[PBSm(PBS+FBS)、PEGF(PBSm+EG+GL)、PEF(PBSm+EG)、PGF(PBSm+GL)]的结晶变化进行了探讨，进而探讨了不同植冰温度(-6℃、-6.5℃、-7℃)、不同冷冻保护液[PBSm(对照)、PEGF、PEF、PGF]对水牛GV期卵母细胞的冷冻保护效果。 1．实验过程中我们将水牛卵巢采卵情况与一同采回的黄牛卵巢采卵情况作了比较：从单个水牛卵巢回收的卵母细胞数平均为4.85个，从单个黄牛卵巢回收的卵母细胞数平均为13.4个，平均每个卵巢回收卵母细胞数水牛明显低于黄牛，外观形态正常、可用的卵母细胞比率也极显著低于黄牛(水牛66.3％，黄牛87.9％，P＜0.01)。 2．在-5.5℃、-6℃、-6.5℃、-7℃四种温度下植冰，以植冰后平衡10min结晶为适宜的保护指标，用PBSm作对照，观察PEGF、PEF、PGF在植冰后不同时问(2，5，8，10，15min)的结晶情况。结果显示：PBSm在四种植冰温度植冰后都很快完全结晶(2min)；植冰温度为-5.5℃时，植冰后10min PEGF、PEF、PGF未完全结晶，15min时PGF仍未完全结晶；植冰温度为-6℃，植冰后10min PEGF、PEF、PGF完全结晶；植冰温度为-6.5℃，植冰后8min PEGF、PEF、PGF完全结晶；植冰温度为-7℃，植冰后5min PEGF、PEF、PGF完全结晶。说明保护液中单独添加GL比单独添加EG有较低结晶速率，PEGF和PEF的结晶效果明显好于PGF和PBSm。在四种植冰温度下表现出温度越低结晶效果越好的趋势。 3．-6℃、-6.5℃、-7℃三种植冰温度下植冰，程序化冷冻解冻水牛GV期卵母细胞的形态正常率为：PEGF(84％、88.37％、90.9％)＞PEF(73.7％、78％、76.7％)＞PGF(58％、59％、57.5％)＞PBSm(50.7％、47.2％、47.4％)。同种植冰下，PEGF与PGF间差异显著(p＜0.05)，PEF与PBSm间差异显著(p＜0.05)，PEGF与PBSm间差异极显著(p＜0.01)。同种冷冻保护液，-6℃、-6.5℃、-7℃植冰，效果差异不显著。 4．-6℃、-6.5℃、-7℃植冰，程序化冷冻解冻后水牛GV期卵母细胞成活率(0.8％台盼兰染色判断)为：PEGF(76.9％、87.5％、83.3％)＞PEF(64.0％、70.8％、66.7％)＞PGF(47.4％、55.0％、55.6％)＞PBSm(16.7％、37.5％、35.3％)。植冰温度为-6℃时的成活率低于-6.5℃和-7℃的成活率。同种植冰温度下，PEGF与PEF间、PEF与PGF间、PGF与PBSm间染色成活率差异不显著，但PEGF与PGF间、PEF与PBSm间差异极显著(P＜0.01)，说明在-6.5℃或-7℃植冰温度下使用PEGF冷冻保护液比较好。西南农业大学硕士学位论文中文摘要旦旦口组且口里口级旦口.口口.. 5一6℃、芍.5℃、一℃三种植冰温度植冰，程序化冷冻解冻后水牛GV期卵母细胞成熟率为:PEGF(1 8.9%、20.5%、20.0%户PEF(9.7%、18.2%、15.6%卜PGF(6.9%、7.7%、8.3%卜PBSm(0、0、0).峨5℃植冰，PEGF作冷冻保护液有2枚卵母细胞发生卵裂，PEF作冷冻保护液有1枚卵母细胞发生卵裂;一℃植冰，PEGF作冷冻保护液有1枚卵母细胞发生卵裂.说明EG和GL混合使用，保护效果好于EG或GL单独使用，据此得出，在双5℃或一7℃植冰，用PEGF作冷冻保护液保存水牛GV期卵母细胞效果比较好。 6.通过将冷冻处理与未冷冻处理的水牛GV期卵母细胞的IVM效果比较，差异极显著 (P<0川)，说明冷冻对水牛GV期卵母细胞的损伤严重. 结果表明:用PEGF作冷冻保护液，装管前用2步法平衡，植冰温度用戒5℃或一℃，植冰后平衡l伽min，以0.3℃lmin降至一5℃投入液氮，解冻采用快速解冻、2步脱出保护剂，对水牛CV期卵母细胞冷冻效果好。