【摘 要】
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1 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ部分基因片段的克隆及表达 参照GenBank中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae,App）血清1型菌株的毒素Ⅳ（ApxⅣ）基因序列
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1 猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ部分基因片段的克隆及表达 参照GenBank中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae,App）血清1型菌株的毒素Ⅳ（ApxⅣ）基因序列设计了一对特异性引物,用PCR方法扩增得到一1096bp的片段,然后克隆到pMD18-T载体中,经测序后与GenBank中公布的核酸序列比较,二者同源性达100%,从T-载体中切下目的片段,定向克隆到pET32a（+）中,转化BL21（DE3）,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE实验,目的基因获得高效表达,免疫转印鉴定呈阳性,ApxⅣ部分基因片段体外成功表达。 2 表达蛋白rApxⅣ和荚膜多糖粗提物的间接ELISA的建立及应用 App的毒素ApxⅣ的部分片段表达产物（rApxⅣ）经Ni-NTA His·Bind Resin纯化后,作为抗原建立了间接ELISA（rApxⅣ-ELISA）,经试验确定抗原包被浓度为0.625μg/ml,血清检测稀释度为1:100,抗原与抗体的最佳反应时间为90分钟。用该ELISA检测了72份实验室制备的猪血清样品,结果预示表达蛋白可用于区分灭活疫苗免疫和野毒感染。 以三氯乙酸-丙酮法提取的App的荚膜多糖粗提物（capsular polysaccharide,Cps）为抗原建立间接ELISA（Cps-ELISA）,经试验确定抗原包被浓度为3μg/ml,血清检测稀释度为1:100,抗原与抗体的最佳反应时间为90分钟。应用该ELISA和猪传染性胸膜肺炎正向间接血凝诊断试剂盒同时检测250份临床样品,试剂盒的检出率为81.2%,Cps-ELISA的检出率为88.8%,二者的符合率达91.4%。 利用建立好的rApxⅣ-ELISA和Cps-ELISA检测了人工发病、疫苗免疫、自然感染和临床感染猪血清中ApxⅣ和Cps抗体水平,实验结果表明Cps-ELISA可以监测疫苗免疫后的抗体水平,而rApxⅣ-ELISA能区分灭活疫苗免疫和野毒感染。 3 猪胸膜肺炎放线杆菌快速PCR检测 根据GenBank中猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae,App）外膜蛋白（OmlA）基因序列,设计合成一对特异性引物,进行PCR检测。App1、2、3、4、5a、5b、6、7、9型参考株均扩增出大小为1010bp左右的片段,而对马链球菌兽疫亚种、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、产
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