人多能干细胞（Human Pluripotent Stem Cells,h PSCs）是一类具有自我更新、不断复制和多向分化能力的多潜能细胞,主要包括胚胎干细胞（ESCs）、胚胎癌细胞（ECCs）和诱导多能干细胞（i PSCs）。由于其发育潜能受到了一定限制,它们不会发育成完整的个体,但可以在一定的发育环境或诱导条件下,分化出多种类型的细胞、组织或器官。目前,多能干细胞已被广泛应用于遗传生殖、再生医学和药物开发等基础研究、临床试验或疾病治疗等方向领域。OCT4是POU转录因子家族成员,在哺乳动物的胚胎发育分化、合子基因激活和体细胞重编程等过程中不可或缺,是多能干细胞在调控自我更新、多能干性、胚层分化及命运决定的关键核心转录因子,而且更具有先锋因子的优先结合DNA发挥转录调控特征。其蛋白功能的实现主要取决于蛋白表达水平,同时依赖于同DNA特异性序列结合构象（如单体MONO、同源二聚体PORE和MORE、异源二聚体SORE四种类型方式）及同其他蛋白之间的相互作用;与此同时,蛋白翻译后修饰对其蛋白稳定和转录活性等功能调节,起到关键或决定作用。蛋白翻译后修饰（Post-Translational Modifications,PTMs）是指发生在蛋白质翻译后自身特定氨基酸残基位点侧链上的一种共价可逆动态的化学基团修饰改变方式,如:磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化、SUMO化等,是一种能够改变蛋白质理化性质、结构功能、定位分布、稳定活性及促进自身成熟的翻译后水平调节机制。据文献报道,目前OCT4蛋白已鉴定报道和验证发现的翻译后修饰有磷酸化、糖基化、SUMO化和泛素化,它们对于OCT4蛋白的识别互作和功能发挥等起到了重要的调控作用,但仍不清楚OCT4蛋白是否有其他新的翻译后修饰类型发生,及其所具体的调控方式与生物学功能意义等。可逆的甲基化修饰调控对于组蛋白的功能调控必不可少,LSD1是第一个发现的（组蛋白赖氨酸特异性）去甲基化酶,近年研究发现其不仅可以广泛调控组蛋白的甲基化修饰,参与调控染色质结构状态的改变与结合基因的转录开启关闭等,而且能够调控一些非组蛋白底物的活性及功能等,例如:抑制p53蛋白的促凋亡活性和调节DNMT1蛋白的活性等,进而参与凋亡、肿瘤发生及DNA甲基化状态等生物学过程。已有文献中利用慢病毒sh RNA和干扰Ch IP实验等,发现报道了LSD1和OCT4在人胚胎干细胞中能够共同靶向占据一些与发育分化相关基因的启动子调控区,提示LSD1去甲基化酶有可能作用于OCT4蛋白发挥调控功能,以及OCT4可能会存在发生非组蛋白这类研究相对较少的甲基化修饰。首先,我们建立了OCT4蛋白甲基化修饰体外孵育检测验证及制备样品系统,通过抗体及质谱检测,首次鉴定发现了OCT4蛋白的甲基化修饰及其候选修饰位点,包括赖氨酸残基和精氨酸残基。通过体外重组蛋白和体内纯化蛋白共同验证发现了OCT4/K222赖氨酸残基的甲基化修饰,初步比较发现该甲基化修饰差异位点可能会与OCT4蛋白调控自我更新及多能干性相关,晶体结构、模拟分析及文献研究中,也证实发现位于OCT4蛋白与DNA特异识别的POUS和POUH结构域之间柔性linker区域上唯一带正电荷的赖氨酸残基K222,在哺乳动物中高度保守并可能或参与分子盐桥、蛋白稳定及重编程效率等功能发挥相关。其次,利用OCT4蛋白甲基化修饰体外孵育系统,我们比较建立了不同细胞裂解液孵育背景条件下的OCT4蛋白甲基化图谱,通过比较分析后发现OCT4/K222位点的甲基化修饰,相比空白对照重组纯化OCT4蛋白背景保留的双甲基化修饰,经过代表多能干细胞的两种类型胚胎干细胞和胚胎细胞裂解液孵育后OCT4蛋白上K222位点的甲基化均完全消失,而代表了分化肿瘤U87细胞裂解液孵育后存在差异并只保留了单甲基化修饰;通过WB检测,我们还发现其修饰状态与不同细胞系中LSD1蛋白的表达水平呈现负相关性。更进一步通过免疫共沉淀和蛋白共定位,发现验证了OCT4蛋白与LSD1蛋白能够发生相互作用并定位分布于细胞核内;而且通过添加重组LSD1蛋白和质谱定量分析等,比较了OCT4/K222去甲基化修饰差异变化,证实了LSD1蛋白能够靶向去除OCT4/K222单甲基化修饰。鉴于蛋白翻译后修饰可能会存在对于OCT4蛋白降解稳定性的潜在影响。我们通过慢病毒sh RNA感染干扰下调LSD1蛋白表达和用LSD1去甲基化酶的活性特异性抑制剂2-PCPA处理细胞两种方法,发现抑制LSD1表达或活性所介导的OCT4蛋白甲基化能够促进自身稳定延长半衰期,同时能绕过且不依赖于蛋白酶体降解途径;不论通过延长2-PCPA药物处理细胞时间,还是利用OCT4/K222F的表达完全模拟甲基化突变体,发现OCT4蛋白甲基化相比野生型蛋白均有相同的趋势,能够在6-12小时之间能够有效和显著促进自身蛋白稳定性和延长半衰期,而且野生型及K222A甲基化缺陷型OCT4蛋白定位上没有明显改变都分布于细胞核内;除此之外,2-PCPA药物减慢了氯喹Chloroquine对OCT4蛋白的加速降解,进一步证实了抑制LSD1活性所介导的OCT4蛋白甲基化或参与溶酶体/自噬降解途径。再者,基于生化实验、我们验证了OCT4局部（POU结构域）晶体解析及模拟预测的推测,证实了带正电荷K222（K85）赖氨酸和带负电荷D166（D29）天冬氨酸之间能够形成盐桥,并能维持OCT4蛋白单体MONO和同源二聚体PORE同源二聚体的结构构象和DNA亲和力。同时发现OCT4/K222F明显地增强了OCT4蛋白PORE同源二聚体结合DNA探针的亲和力;以及OCT4蛋白同源二聚体MORE,相比同源二聚体PORE有更强的DNA亲和力。体外荧光素酶报告系统检测发现SORE、PORE、MORE和MONO四种构象,在细胞中具有明显的转录活性差异,MORE最高、其次为PORE,而且惊讶地发现OCT4/K222F或以疏水作用,特异性且强烈地抑制了OCT4蛋白同源二聚体PORE的体外转录活性,并以“锁定（Lock-in）”方式在体外能够停滞和阻止RNA转录复合物的功能活性,导致转录活性强烈抑制。为了在体内生理条件下揭示OCT4/K222甲基化修饰的生物学功能意义,通过比较发现OCT4/K222A和OCT4/K222F突变体,在人胚胎干细胞H9生理条件下,也能够像体外一样弱化或抑制内源含有同源二聚体PORE构象特异识别元件基因的转录导致下调,并且发现这些含有完全匹配特异识别序列/PORE（T）的基因功能,主要与细胞命运决定、细胞连接/细胞骨架的组织和信号通路（例如Hippo,MAP和钙信号途径等）的功能调控有关。由于维甲酸RA诱导处理的NCCIT细胞中,大多数PORE（T）基因的表达与OCT4/K222A和OCT4/K222F突变体趋势相近或一致,因而OCT4/K222甲基化或神经外胚层分化有关。同时,NCBI数据库查找Blast的生信数据和人胚胎干细胞中OCT4蛋白结合基因Ch IP实验数据,证实了我们所找的绝大多数PORE（T）靶向基因,均能被OCT4蛋白直接结合以及受其调控。与此同时,我们初步证实发现了99个含有PORE元件的靶基因,通过String蛋白互作分析后全景式发现它们可能主要与多能干细胞的m RNA/mi RNA、神经发育、细胞粘附分裂、G蛋白/钙信号、DNA损伤、蛋白降解和葡萄糖代谢等信号通路功能相关。在对多能细胞功能的检测分析中,当与H1细胞（男性,XY）对比,OCT4/K222F能够下调人胚胎干细胞H9（女性,XX）中多能干性及三胚层分化标志物基因的转录,仅有外胚层标志物HES4基因共性下调,也提示了OCT4蛋白甲基化可能主要与神经外胚层分化相关。通过进一步检测分析及药物抑制剂联合处理多能干性人胚胎癌NCCIT细胞,我们发现两种LSD1抑制剂2-PCPA和OG-L002,仅会对个别基因的下调趋势相近（SOX2和HES4）,但OG-L002下调覆盖基因和下降趋势均与OCT4/K222F作用于H9细胞的总体趋势高度一致（包括多能干性及三胚层分化每个方向基因）,表明抑制LSD1活性所介导的OCT4/K222甲基化修饰,可能会对神经外胚层分化（HES4决定分支）产生相对较早非常敏感地抑制作用,并随着作用时间延长及OCT4/K222甲基化积累,或会对胚胎干细胞的干性基因及中内胚层都产生抑制干扰紊乱作用,提示OCT4/K222甲基化修饰能够抑制多能干细胞的干性和分化功能,而LSD1所介导的OCT4/K222去甲基化能够维持保护多能干细胞的自我更新及细胞干性。综上所述,本文首次发现并确证了OCT4蛋白的甲基化修饰,以及作用位点、调控方式、靶向基因和细胞功能等,揭示了OCT4蛋白甲基化修饰的调控机制以及生物学功能。通过研究LSD1去甲基化酶所介导的非组蛋白OCT4/K222去甲基化,我们揭示了一种表观遗传因子和多能性因子之间的新型相互作用方式,举例说明了OCT4蛋白的特异性位点PTM如何关键性地调节PSC的多能干性及细胞分化,在丰富拓展了我们的认知视野的同时,也为我们深入认知探索胚胎发育和胚层分化等提供了新的线索依据。除此之外,鉴于越来越多的研究发现OCT4蛋白在很多人体肿瘤细胞及肿瘤干细胞中表达发挥作用,因此我们的研究发现或可能还会对于肿瘤发生和肿瘤干细胞的研究提供极大帮助、丰富思路及拓展视野。