控制桃分枝角度相关基因PpLAZY1和PpHSFA2D克隆及PpLAZY1基因功能分析

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分枝角度是形成理想树形的重要组成部分,其与植物的产量形成、适应环境能力和竞争能力密切相关。桃(Prunus persica.L)是蔷薇科落叶果树,是世界大宗果树之一。近年来,随着果园管理机械化的广泛应用,柱形桃这一特殊的种质资源以树姿直立、分枝角度小、分枝数量少、树冠小、适宜高密度栽培等优势受到育种工作者的青睐,同时也引起了国内外学者的广泛关注。但由于其多为观赏类型,无法实现花果两用,采用常规育种手段将柱形性状引入栽培桃类型存在育种周期长等困难。因此,发掘控制桃分枝角度相关基因,解析分枝角度形成机理成为科研工作者的关注热点。影响植物分枝角度形成的相关基因的研究主要集中在水稻、玉米、小麦等单子叶植物及模式植物拟南芥中。桃树的株型是众多遗传、发育和环境因素相互作用的结果,目前研究相对较多的主要是LAZY1、TAC1、LPA1基因以及PIN1b、PIN2、LIC等不同激素调节机制中的相关基因。本研究以普通形桃‘大久保’和柱形桃‘洒红龙柱’为研究对象,克隆PpLAZY1基因,分析PpLAZY1基因在两种树形不同组织部位间的表达差异,对PpLAZY1进行亚细胞定位分析,并构建过表达载体转化拟南芥进行功能验证:此外,利用同源克隆获得PpLAZY1基因的上游调控基因PpHSFA2D的CDS全长,对其在两种树形不同组织部位间的表达特性进行分析。上述研究结果一方面为从分子水平解析桃分枝角度形成提供理论依据,另一方面为通过分子育种手段对现有主栽桃品种树形进行改良、创造优异新种质奠定基础。主要结果如下:1、桃PpLAZY1基因克隆及功能分析(1)PpLAZY1基因克隆及生物信息学分析。利用‘大久保’和‘洒红龙柱’幼嫩叶片cDNA为模板,通过RT-PCR扩增,克隆得到PpLAZY1基因。PpLAZY1基因CDS全长1161 bp,编码386个氨基酸,序列中具备IGT基因家族特征结构(GφL-(A/T)),共含有五个保守结构域,且在第五个结构域中包含EAR-like特征基序(LVLEL)。运用Protparatam在线预测其蛋白质的理论分子量为43.15 kD,pI为6.49,不稳定指数是44.37(不稳定),分子式为C1871H2977N533O614S12,由22种氨基酸组成,脂溶指数为62.98,总平均疏水指数为-0.882,具疏水性;系统发育进化分析结果表明PpLAZY1与梅花亲缘关系最近,与高粱亲缘关系最远。(2)PpLAZY1基因在‘大久保’和‘洒红龙柱’桃中的组织(器官)表达分析。利用qPCR分析PpLAZY1基因在‘大久保’和‘洒红龙柱’桃中不同组织器官的表达量,结果表明:PpLAZY1基因在‘洒红龙柱’中大多部位的表达量高于‘大久保’;在与分枝角度形成相关的三个部位(分枝连接处韧皮部上部、分枝连接处韧皮部下部和分枝连接处混合样)的表达量在‘洒红龙柱’中均显著高于‘大久保’;通过构建L101-PpLAZY1-YFP亚细胞定位融合表达载体,利用瞬时表达技术转化本氏烟草叶片,通过激光共聚焦显微镜观察PpLAZY1亚细胞定位情况,结果表明:PpLAZY1定位在细胞膜。(3)PpLAZY1基因功能验证。成功构建了 35S::PpLAZY1过量表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染野生型拟南芥。通过对拟南芥的筛选和表型观察,过表达PPLAZY1基因拟南芥T2代转基因植株与野生型拟南芥相比,株高和莲座叶数量无显著差异,分枝角度在初生时期显著小于野生型,转基因拟南芥前期营养生长时间长,总生长周期长于野生型拟南芥。2、PpHSFA2D的克隆与不同组织部位表达分析利用‘大久保’和‘洒红龙柱’幼嫩叶片cDNA为模板,克隆得到PpHSFA2D基因。PpHSFA2D基因CDS全长1080 bp,编码359个氨基酸,通过两个树形不同组织部位(11个)的表达分析发现,PpHSFA2D基因在‘洒红龙柱’11个部位中的表达水平均高于‘大久保’,表达趋势与PpLAZY1基因大致相同,在分枝形成部位的分枝连接处韧皮部(上)、分枝连接处韧皮部(下)和分枝连接处混合样均呈现相同的表达模式。该结果为进一步研究PpHSFA2D的功能以及与PpLAZY1之间的调控关系奠定基础。
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