小麦分蘖调控基因TaTAC1的克隆及功能分析

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:scarllie
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分蘖是禾谷类作物在其生长发育过程中形成的分枝,是株型建成的重要指标,与作物产量密切相关。分蘖性状是株型研究的重要内容之一,其中分蘖角度调控分蘖间隙,对光截获和邻近植株间的竞争至关重要,分蘖数则是作物产量形成的关键因素;通过选择培育具有合适分蘖性状的小麦品种,能极大改善株型并提高其产量。了解小麦分蘖的分子遗传机制,挖掘有利的等位基因,有助于改良株型和培育高产小麦新品种。本研究以一个四倍体小麦株型直立紧凑突变体为实验材料,利用BSA(Bulk Segregant Analysis)+660K SNP芯片技术,并借助生物信息学手段成功克隆出一个控制小麦分蘖角度的基因,该基因与水稻分蘖调控基因Os TAC1高度同源,因此将该基因命名为TaTAC1。通过对TaTAC1突变体、转基因和相关遗传群体的调查,初步分析了其形态学特征,遗传定位,时空表达模式和启动子转录活性等相关功能。主要研究结果如下:1.研究前期从四倍体小麦Kronos EMS突变体库中筛选到一个分蘖角度显著减小、株型变直立紧凑的突变体,将该突变体同野生型进行回交并自交,在BC2F2代选取极端表型植株进行混池测序,利用小麦660K SNP芯片,结合生物信息学技术对定位区段内的所有基因进行分析,同时对关键基因进行测序比对,最终确定目标基因TaTAC1。2.从六倍体小麦中国春(CS)中分离出TaTAC1分别位于5A、5B和5D染色体上的三个等位基因TaTAC1-A1、TaTAC1-B1和TaTAC1-D1,其g DNA全长分别为:1335 bp,1336 bp和1335 bp,均由四个外显子和三个内含子组成,包括783 bp的开放阅读框,编码一个260个氨基酸的蛋白,预测蛋白大小分别为:29132 Dα,28912 Dα和29012 Dα;通过RACE检测,得到了TaTAC1三个等位基因的5’和3’非编码区(UTR)序列信息,5’-UTR长分别为:46 bp,45 bp和156 bp,3’-UTR长分别为:361 bp,362 bp和335 bp;将三个等位基因的CDS分别和各自的5’-UTR及3’-UTR组装,得到三个等位基因各自完整的c DNA序列信息,其c DNA序列全长分别为:1190 bp,1190 bp和1274 bp;3.通过构建TaTAC1-GFP共表达载体,对其融合蛋白进行亚细胞定位,发现TaTAC1在烟草表皮细胞的细胞质、细胞膜和细胞核中均有表达,表明其是组成型表达的蛋白。4.选取CS不同组织部位进行实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测,分析TaTAC1的时空表达模式,结果表明TaTAC1基因主要在茎节和叶环中高度表达,说明其可能主要调控小麦的分蘖角度和叶夹角;进一步以CS和四倍体小麦Kronos(KWT)的茎节部位为材料,对TaTAC1等位基因TaTAC1-A1、TaTAC1-B1和TaTAC1-D1的表达量进行分析,发现TaTAC1-A1等位基因优势表达,推测TaTAC1-A1为TaTAC1发挥功能的主要等位基因型。5.通过对TaTAC1-A1转基因小麦T3代植株和对照轮选987(LX987)植株的表型观察和定量分析发现,在全生育期内,T3代转基因植株具有较对照LX987更多的分蘖数、更大的分蘖角度及叶夹角,进一步证明了TaTAC1基因对分蘖的调控作用。6.对T3和LX987植株基部组织内源激素含量进行测定,发现生长素(IAA)和细胞分裂素(CTK)在转基因植株中的含量显著高于对照植株,而独脚金内酯(SL)的含量低于对照植株,由此推测,TaTAC1可能通过内源植物激素的调节而影响小麦的分蘖。7.通过分离TaTAC1-A1等位基因的启动子,发现具有较大分蘖角度和较小分蘖角度的小麦品种启动子区域存在一个242 bp插入/缺失多态性,将起始密码子上游拥有242 bp缺失的等位变异命名为TaTAC1-A1a,将起始密码子上游拥有242 bp插入的等位变异命名为TaTAC1-A1b,并据此开发多态性标记;之后对153份小麦遗传群体进行多态性分析,发现拥有TaTAC1-A1a等位基因的小麦品种具有较小的分蘖角度,而拥有TaTAC1-A1b等位基因的小麦品种则具有较大的分蘖角度。推测TaTAC1带来的分蘖表型差异,可能是TaTAC1-A1等位基因在启动子区域这一242 bp插入/缺失多态性造成的。8.利用GUS报告基因系统对TaTAC1-A1等位基因两种启动子变异进行GUS染色和GUS活性检测,结果表明TaTAC1-A1b类型启动子的转录活性较TaTAC1-A1a类型的高,进一步验证了两种等位变异的启动子类型转录活性存在差异。
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