石榴是具有经济效益、观赏价值及药用价值等优良品质的优良果树,石榴品种较多,但现在市场上推广的品种或多或少都存在着一些问题和缺陷,其中在石榴栽培中冻害问题较为严重,已经成为石榴栽培中的瓶颈,因此,品种的优化也成为了石榴生产中的关键问题。利用传统育种手段育种周期长,且育种进程缓慢,植物转基因技术的应用及推广,为实现植物目标性状改良的一种快速和直接的途径。本研究为了建立完善的石榴遗传转化转化体系,利用农杆菌介导法以石榴胚培苗的子叶和叶片为外植体,进行石榴遗传转化体系的优化,为石榴遗传育种提供技术支持;并克隆得到石榴抗寒相关基因PgICE1,对其进行生物信息学分析,构建过表达载体转化拟南芥和石榴验证基因功能,以期为利用基因工程手段培育石榴抗寒新种质奠定基础。主要研究结果如下:1.石榴遗传转化体系优化（1）农杆菌侵染后子叶和叶片诱导分化丛芽的最适培养基筛选。将侵染后的外植体材料接入以MS+0.3 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 KT+500 mg·L-1 Cef为对照,筛选诱导分化丛芽的最适TDZ浓度。子叶诱导培养基将TDZ浓度设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1,筛选出诱导子叶分化丛芽的最适培养基为:MS+2.0 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 KT+500 mg·L-1 Cef,丛芽分化率可达86.67%;叶片诱导培养基TDZ浓度设置为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-1,筛选出诱导叶片分化丛芽的最适培养基为:MS+3.0 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 KT+500 mg·L-1 Cef,丛芽分化率为 27.78%;（2）诱导丛芽伸长的最适培养基筛选。将带有丛芽的外植体接入以MS为基本培养基,设置6-BA和NAA不同浓度配比的培养基,筛选最适培养基为:MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT+0.3 mg·L-1 GA3+500 mg·L-1 Cef,不定芽整体的长势均匀,长势良好,不定芽嫩绿且叶片舒展;（3）不定芽筛选及不定芽培养的最适培养基筛选。待不定芽伸长至3-4 cm后,将其从茎基部切下接入以MS为基本培养基,设置6-BA和NAA不同浓度配比的筛选增殖培养基,探究最适的筛选培养基,得到子叶所诱导的不定芽的遗传转化率在45.45-51.11%,叶片所诱导的不定芽的遗传转化率在33.33-38.89%,并找到最适的筛选不定芽培养基为:MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 GA3+200 mg·L-1 Cef,不定芽增殖系数可达到3.2,增殖芽长势均匀,增殖旺盛;（4）石榴试管嫁接及移栽最适培养基筛选并进行抗性不定芽试管嫁接再生。以‘突尼斯软籽’石榴实生苗作为接穗嫁接于‘豫大籽’实生苗所制不带子叶砧木上,探究不同浓度6-BA对石榴试管嫁接及移栽成活影响的预实验,将嫁接苗接入以MS+0.1 mg· L-1 NAA为对照,6-BA浓度设置为0.5、1.0、1.5和2.0 mg· L-1的培养基,试验结果表明最适的石榴转化不定芽试管嫁接的培养基为:MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+200 mg·L-1 Cef,嫁接成活率和移栽成活率分别为96.67%和70.00%;将抗性不定芽进行试管嫁接,获得5株移栽成活的抗性芽嫁接苗,对移栽成活的5株再生植株进行PCR检测,两株可扩增出目的片段。2.PgICE1基因克隆及功能分析（1）PgICE1基因克隆及生物信息学分析。克隆分析得到PgICE1基因开放阅读框长1095 bp,预测编码394个氨基酸,为亲水酸性蛋白质;预测到PgICE1定位在细胞核;此外,二级结构分析可知PgICE1中存在α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延长链4种二级结构;预测PgICE1蛋白三级结构表明PgICE1蛋白属于MYC2型转录因子蛋白;进行结构域分析,发现PgICEJ基因在其包含的多个结构域中存在有一个作为转录因子的bHLH结构域与大多物种中的抗寒基因ICE1的功能结构域极为相似;构建进化树分析,得到PgICE1蛋白与桉树ICE1同源性最高,可达73%,与山葡萄ICE1同源性可达到60%;（2）PgICE1基因表达分析。对石榴叶片进行低温处理后通过RT-PCR分析,发现在石榴感受到低温胁迫时会迅速诱导PgICE1基因的表达;（3）PgICE1基因转化石榴和拟南芥。构建PgICE1-pSAK277过表达载体,同步将其转入石榴和野生型拟南芥中,成功在石榴中获得转化PgICE1基因的抗性芽,并成功得到过表达PgICE1拟南芥植株,转基因植株抗寒性试验正在进行中。