论文部分内容阅读
【研究背景与目的】妊娠始于胚胎成功的着床,胚胎着床有两个先决条件:即优质的胚胎和处于接受态的子宫内膜。随着医学技术的不断发展,体外受精-胚胎移植（In vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET）、植入前诊断（PGD）等辅助生殖技术的普及,胚胎质量的问题日渐改善,但总体的辅助生殖成功率仍不超过50%,而失败中的大约三分之二考虑与内膜因素相关。因此,子宫内膜容受性的问题成为生殖领域的主要研究热点之一。所谓容受性,即接受胚胎的能力,其中涉及相关细胞的增殖、分化、凋亡等多种调控机制,同时也与多种激素的分泌息息相关。TOB1（人类Erb B-2转录因子1）属于抗增殖蛋白家族BTG/TOB的一员,可以通过BMP-SMAD通路、MAPK/ERK等通路影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程。相关细胞的增殖、分化和凋亡等过程与容受性密切相关,但尚未见其与子宫内膜蜕膜化相关的研究报道,因此,本文旨在研究TOB1在子宫内膜各个时期的表达情况及探讨其影响蜕膜化的可能机制,期待能够找到改善子宫内膜容受性的新靶点。【材料与方法】1、检测TOB1在人类月经周期不同时期子宫内膜中的表达情况。收集10例在我院妇科门诊行宫腔镜手术患者的子宫内膜样本（月经不同时期）,术后经病理证实其具体分期,通过western blot及q RT-PCR等方法来检测子宫内膜在增殖期和分泌期中TOB1的表达差异。2、建立体外细胞模型,进一步研究蜕膜化前后的TOB1变化及其对细胞周期的影响。应用E2P4诱导子宫内膜基质细胞（HESCs）蜕膜化,构建细胞模型,通过Westernblot和免疫荧光的实验方法检测蜕膜化标志物（IGFBP-1、PRL）的表达,建模成功后予CCK-8测定其蜕膜化前后的细胞增殖活性,采用流式细胞分析技术检测诱导蜕膜化前后细胞周期的变化。3、探索TOB1影响蜕膜化的可能机制。使用Western blot检测Notch和TOB1在蜕膜化前后的表达情况,后使用si RNA敲低TOB1后测定Notch1的表达情况;此外,使用Notch抑制剂DAPT处理后,检测TOB1的表达,以及细胞周期的改变。【结果】1、通过对在体人子宫内膜组织进行检测,发现与增殖期相比,TOB1在分泌期样本中明显上调,q RT-PCR、免疫组化和Western blot等实验结果同时显示在分泌期标本中TOB1表达水平较增殖期明显升高,且差异具有统计学意义（p<0.05）。2、使用子宫内膜基质细胞系进行了体外细胞实验,使用E2、P4诱导子宫内膜基质细胞（HESCs）蜕膜化成功后,通过Westernblot和免疫荧光检测到蜕膜化后TOB1表达较前升高,且差异具有统计学意义（p<0.05）。3、为研究TOB1的表达对于内膜细胞的影响,进行了CCK-8试验和流式细胞检测,发现当蜕膜化后,内膜细胞的活性有所下降,且流式的检测结果提示内膜细胞停滞在G1期,通过对G1期的周期蛋白进行定量分析,也得出内膜细胞停滞在G1期的结论。4、使用si RNA干扰TOB1后,通过CCK-8和流式细胞检测的实验表明,干扰TOB1可以恢复部分细胞的增殖活性,使停滞在G1期的细胞减少,进入S期的细胞较前增多,从而影响蜕膜化的进程。同时,干扰TOB1后使G1期相关因子Cyclin D1、Cyclin E1和CDK2的表达上调,表明TOB1使内膜细胞在G1期停滞,促进其分化为蜕膜细胞,当敲降TOB1后细胞得以恢复增殖。5、蜕膜化后,检测到Notch1的表达上调,与TOB1的表达趋势一致,而当si RNA成功的敲降TOB1后,Notch1的表达出现下降,使用Notch抑制剂DAPT处理后,Notch1表达降低,但TOB1的表达无明显改变。表明TOB1是Notch1的上游调节器,TOB1是通过Notch1通路来影响内膜细胞周期变化,使其停滞在G1期,从而抑制内膜细胞的增殖活性,促进内膜细胞的蜕膜化改变。【结论】研究表明蜕膜化后的分泌期子宫内膜TOB1表达水平较增殖期明显升高（p<0.05）,TOB1在子宫内膜蜕膜化过程中起着重要作用。体外实验进一步表明TOB1可能通过TOB1/Notch级联效参与调控蜕膜化,使基质细胞停滞在G1期。