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第一部分siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定目的:用前期实验筛选获得的CLIC1 siRNA3片段构建重组慢病毒载体,进一步构建稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株,实时荧光定量PCR筛选抑制率最好的单克隆胃癌细胞株。方法:（1）直接用前期研究已经筛选出的CLIC1 siRNA3为沉默CLIC1基因的最有效片段。制备双链DNA oligo,利用基因重组技术克隆到慢病毒表达载体GV115中,双酶切后行DNA测序鉴定重组慢病毒载体。将慢病毒包装辅助质粒和制作的含CLIC1 siRNA的重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用孔稀释法测定病毒滴度。另外,利用上海吉凯公司的阴性序列病毒作为阴性对照。（2）将病毒分别感染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,各挑取6组GFP强表达的细胞克隆团转移种植建立两稳定单克隆细胞株,荧光定量PCR检测CLIC1抑制率,选取抑制率最好的克隆组。结果:经测序成功构建针对CLIC1的重组慢病毒RNA干扰表达载体;利用293T细胞包装重组慢病毒载体后成功收集到重组慢病毒颗粒,其病毒滴度为:1.2E+9 TU/mL;利用重组慢病毒颗粒感染两株胃癌细胞,感染效率均在80%以上;成功扩增并分别获得6组稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株;荧光定量PCR鉴定获得抑制效率最好的单克隆胃癌细胞株;SGC-7901和MGC-803单克隆株的CLIC1抑制率分别为89.3%和93.8%。结论:成功构建CLIC1 siRNA干扰慢病毒载体,并成功获得抑制效率较好的低表达CLIC1稳转胃癌细胞株,为下一步探讨沉默CLIC1对胃癌生长的体内体外实验奠定良好的基础。第二部分siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨siRNA干扰CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:用MTT法检测抑制CLIC1表达前后细胞的增殖情况;用AnnexinV-APC单染进行流式细胞技术检测,观察抑制前后各组细胞凋亡变化情况;用PI单染的方法检测各组细胞周期变化情况;用Transwell小室及Matrigel胶检测细胞侵袭和迁移能力的变化。结果:转染后24h、48h、72h、96h、120h干扰组A值均低于空白对照组和阴性对照组（均P<0.05）;SGC-7901干扰组转染后24h、48h、72h、96h、120h 的细胞增殖率分别为 27.829%、52.663%、71.785%、28.778%和20.450%;MGC-803 干扰组分别为 16.910%、42.169%、127.244%、101.388%和34.118%。SGC-7901（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:0.743±0.031 vs 0.587±0.025 vs 0.597±0.032,F=26.628,P<0.01）和 MGC-803（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:4.370±0.125 vs 1.453±0.166 vs 1.510±0.079,F=506.432,P<0.01）干扰组的细胞凋亡率均显著高于各自的空白对照组和阴性对照组。在SGC-7901细胞中,干扰组G0/G1期比例显著低于空白对照组及阴性对照组（F=172.299,均P<0.01）,G2/M期比例显著高于空白对照组及阴性对照组（F=2665.338,P<0.01）;在MGC-803细胞中,G2/M期细胞比例干扰组也显著高于空白对照组及阴性对照组（F=631.560,P<0.01）,G0/G1及G2/M期细胞比例均显著低于空白对照组及阴性对照组（F=889.621,P<0.01）。干扰组侵袭、迁移实验中的穿膜细胞数（SGC-7901 分别是:86.000±6.000、118.333±8.505,MGC-803:81.333±5.033、108.667土8.327）均显著低于空白对照组（SGC-7901分别是:156.667±14.843、181.667±11.719,MGC-803:168.333±17.388、185.000±11.000）和阴性对照组（SGC-7901 分别是 150.333±13.051、178.667土7.024,MGC-803:161.000土 15.716、179.333土10.408）（均 P<0.01）。结论:抑制CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803增殖增快、凋亡增加、细胞周期阻滞在G2/M期、侵袭迁移能力受到抑制。提示抑制CLIC1是胃癌基因治疗的一个潜在有效的靶点。第三部分基于iTRAQ蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白目的:应用iTRAQ结合质谱分析的蛋白组学技术分析对比抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC7901的差异表达蛋白。方法:提取两组细胞的总蛋白,经蛋白质酶解、iTRAQ标记、质谱分析和数据库搜索等步骤后,筛选出符合条件的蛋白质:114/115的比值≥2.0或≤0.5;最后对差异蛋白进行生物信息学分析。结果:抑制CLIC1表达后在Human数据库中共鉴定到1170个蛋白肽段,差异蛋白54个,36个上调表达,18个下调表达;Mouse数据库中鉴定到858个蛋白肽段,差异蛋白39个,上调表达24个,下调表达15个。差异蛋白主要定位于细胞内,以结合作用和生物调节作用为主。结论:筛选出了一组与CLIC1沉默相关的差异蛋白,为明确CLIC1在胃癌中的作用机制提供了线索和基础。第四部分siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞整合素和凋亡基因mRNA及蛋白的影响目的:探讨抑制CLIC1表达后胃癌细胞中部分凋亡和整合素相关基因及蛋白的表达情况。方法:应用实时荧光定量PCR和Western blot检测胃癌细胞中整合素（α1、α3、αv、β 1）和凋亡（Bcl-2、survivin、Fas）相关基因和蛋白的表达情况。结果:（1）SGC-7901和MGC-803干扰组细胞中整合素α3、αv和β1基因表达均显著下降（SGC-7901:52.547%、33.766%、34.132%和 MGC-803:56.500%、51.900%、76.347%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901 中表达升高（干扰组vs空白对照组vs阴性对照:1.705±0.096 vs 1.000±0.014 vs 0.931±0.016）,在 MGC-803 中表达下降（0.503±0.059 vs 1.000土0.038 vs 1.011 土0.059）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（2）两组细胞中整合素 α3、αv和β1 蛋白表达均显著下降（SGC-7901:70.924%、35.491%、55.209%和 MGC-803:46.729%、53.765%、70.935%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901中表达干扰组高于空白对照组和阴性对照组（1.577±0.021 vs 0.610±0.046 vs 0.650±0.044）,在 MGC-803 中表达下降（0.607±0.031 vs 1.123±0.040 vs 1.110±0.046）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（3）两干扰组中Bcl-2基因和蛋白的表达均下降（mRNA:65.200%和74.725%,蛋白:60.023%和54.023%）（均P<0.05）,Fas基因和蛋白的表达均上升（mRNA:97.702%和 173.826%,蛋白:83.091%和 76.935%）（均P<0.05）,survivin 表达不变（P>0.05）。结论:（1）从基因和蛋白水平检测发现沉默CLIC1表达后两株胃癌细胞中的整合素α3、αv、β1均下调表达;胃癌细胞SGC-7901中的整合素α1上调表达,MGC-803中则下调表达。结合整合素在肿瘤中的作用,初步认为CLIC1基因沉默通过调节整合素的表达影响胃癌的进展。（2）抑制胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的CLIC1表达后凋亡蛋白Fas表达上调、Bcl-2表达下调、Survivin表达无变化。结合第二部分生物学功能实验结果,Fas和Bcl-2表达的变化能促进沉默CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的凋亡。