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背景:β地中海贫血是一种严重危害人类健康的遗传性溶血性疾病,其分子遗传学基础是β珠蛋白基因的缺失或缺陷,使β珠蛋白链的合成缺乏或不足,造成α与非α珠蛋白链合成的不平衡,过多的α珠蛋白链形成包涵体,沉积在红系祖细胞和红细胞,造成细胞死亡和无效造血,引起贫血、溶血、骨骼改变等地贫表现。临床研究发现,增加胎儿血红蛋白（Fetal Hemoglobin,HbF）的合成能减轻β地中海贫血病人的临床表现。已有的研究表明,Bcl11A、SOX6、KLF1及KLF2是调控HbF表达的相关转录因子,但是针对β-地中海贫血患者靶向调控SOX6、KLF1和KLF2的表达诱导HbF合成治疗β地中海贫血的实验研究,国内外未见报道。针对中国常见的基因型β-地中海贫血患者,靶向调控Bcl11A的表达诱导HbF合成治疗β地中海贫血患者的实验研究,国内外未见报道。目的:在K562细胞系和以正常人及广西常见基因型β地中海贫血（IVS-Ⅱ-654、41/42及血红蛋白E/β-地贫）病人单个核细胞（mononuclear cell MNC）为对象,在体外分化的红细胞中,运用慢病毒载体基因感染细胞,分别抑制Bcl11A、SOX6、KLF1和KLF2的表达,采用实时荧光定量多聚酶链反应（Real time fluorescentquantitative Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）,蛋白质免疫印迹方法（Western Blot）方法在信使核糖核酸（MessengerRibonucleic Acid,mRNA）和蛋白层面观察其对人γ珠蛋白基因的调控作用。方法:1.通过人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque）密度梯度离心法提取正常人经粒细胞集落刺激因子（recombinant humangranulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF）动员后外周血和β地中海贫血患者骨髓和/或外周血里的MNC,接种于本实验室已建立的一步法体外液体红细胞培养体系,促进MNC向红细胞分化,定期观察培养细胞黑白倒置相差显微镜下形态,Geimsa染色细胞形态及细胞形态分类计数;分化终末流式细胞仪检测红系分化特异抗原CD235a确定分化效率。通过RT-PCR的方法观察红系分化培养过程中CD235a、β、γ珠蛋白基因表达的动态变化。2.运用小RNA干扰原理和脂质体转染的方法,以Bcl11A、SOX6、KLF1及KLF2 shRNA候选质粒转染K562细胞系或者293FT细胞系,转染48小时后提取细胞RNA,反转录为cDNA,采用RT-PCR方法在mRNA层面验证各质粒的抑制效果;转染72小时后,提取细胞蛋白,运用Western Blot在蛋白层面验证各质粒的抑制效果,选取抑制效果最佳的质粒包装含目的shRNA片段的慢病毒。3.将含目的shRNA片段的质粒与辅助质粒VSVG 1.0载体,Δ8.9载体共转染293FT细胞,转染72小时后,收获培养基上清中的病毒。将病毒浓度梯度稀释,感染1080细胞,嘌呤霉素筛选病毒感染阳性细胞,结晶紫染色活细胞测试病毒滴度。4.分别在K562细胞系,正常人MNC体外分化的红细胞及β地中海贫血患者MNC体外分化的红细胞中感染慢病毒。在K562细胞系,采用RT-PCR和Western Blot方法从mRNA和蛋白两个层面检验Bcl11A、SOX6、KLF1和KLF2四个因子的抑制效果和对γ珠蛋白基因的调控作用;在正常人MNC细胞体外分化的红细胞和β地中海贫血患者MNC细胞体外分化的红细胞中,采用RT-PCR方法在mRNA水平检验Bcl11A、SOX6、KLF1和KLF2四个因子的抑制效果和对Y珠蛋白基因的调控作用。结果:1.在体外红细胞分化实验中,随着体外培养时间的延长,倒置显微镜下可见培养体系内出现较多具有红系特征的橘红色细胞集落;Geimsa染色形态学证实培养细胞逐渐由原始红细胞向成熟红细胞分化。随着分化时间延长,培养体系里红细胞比例逐渐增加,至第15天,各发育阶段红细胞比例可达到90%以上,流式检测红系特异性抗原CD235a的表达达87%。CD235a、β珠蛋白基因与γ珠蛋白基因RNA表达量随着分化时间延长逐渐增加;γ/β mRNA的比例随着分化时间延长逐渐下降。2.在K562细胞系中,分别下调BCL11A与SOX6因子后,γ珠蛋白基因表达在mRNA与蛋白水平均升高。在正常人MNC体外分化的红细胞和β地中海贫血患者MNC体外分化的红细胞中,分别下调BCL11A与SOX6后,γ珠蛋白基因表达在mRNA水平升高。下调BCL11A与SOX6因子后,未观察到对红系分化有明显影响。3.在K562细胞系中,下调KLF1后,γ珠蛋白基因表达在mRNA与蛋白水平均降低;除此之外,下调KLF1后,β珠蛋白基因与BCL11A基因表达在mRNA与蛋白水平均下降,KLF2基因在mRNA与蛋白水平均增加。在K562细胞系中,下调KLF2后,γ珠蛋白基因表达在mRNA与蛋白水平均降低;在正常人MNC体外分化的红细胞和β地中海贫血患者MNC体外分化的红细胞中,下调KLF1后,在mRNA水平,γ/α珠蛋白比例升高,但下调KLF1后MNC向红系分化的效率降低,同时在mRNA层面,可以观察到KLF2的升高。在β地中海贫血患者MNC体外分化的红细胞中,下调KLF2后,γ珠蛋白基因表达在mRNA水平升高。结论:1.分别下调BCL11A与SOX6的表达,在K562细胞系,正常人MNC体外分化的红细胞及β地中海贫血患者MNC体外分化的红细胞中均可以上调γ珠蛋白基因表达,其中下调SOX6在β地中海贫血患者MNC体外分化的红细胞中观察到的Y珠蛋白基因表达的上调在国内外属首次报道。2.下调KLF1在K562细胞系里观察到Y珠蛋白基因表达的下降,提示KLF1对于Y珠蛋白基因表达可能有正向调节和负向调节的双重作用,具体的调节作用可能与KLF1作用的背景,协同因子和KLF1本身不同的修饰状态的有关,KLF1因子对Y珠蛋白基因表达调控的具体机制尚需进一步研究。下调KLF1在体外分化红细胞中虽然观察到Y/α mRNA 比例升高,但是显著影响了红系的分化效率,故KLF1可能并不是一个理想的调控HbF合成的分子靶点。3.下调KLF2在K562细胞系里观察到Y珠蛋白基因表达的下降,下调KLF2在β地中海贫血患者MNC体外分化的红细胞中观察到Y珠蛋白基因表达的升高。在不同种类的细胞里,靶向下调KLF2观察到对Y珠蛋白基因有正向调节和负向调节的双重作用,可能与KLF2作用的背景不同有关。KLF2因子对Y珠蛋白基因表达调控的具体机制尚需进一步研究。在K562细胞系与人体外分化红细胞中,下调KLF2,观察其对Y珠蛋白基因表达的影响,国内外均未有报道。4.下调KLF1的表达后,在K562细胞系和在正常人MNC细胞体外分化的红细胞及β地中海贫血患者MNC细胞体外分化的红细胞中,均观察到KLF2表达的升高;提示KLF2有代偿KLF1的作用。在K562细胞系和在正常人MNC细胞体外分化的红细胞及β地中海贫血患者MNC细胞体外分化的红细胞中,揭示KLF2对KLF1的直接代偿作用在国内外属首次报道。