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第一部分构建及鉴定低表达CLIC1稳转人胃癌裸鼠皮下瘤和原位瘤模型目的:用前期实验获得的稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株构建裸鼠皮下瘤和原位瘤模型,利用Protein Simple Wes技术（简称WES技术）进行鉴定。方法:1.培养各株胃癌细胞即空白对照组（Control,CON组）包括SGC-7901和MGC-803,阴性对照组（Negative Control,NC组）包括SGC-7901-NC和MGC-803-NC1,干扰沉默组（Knock Down,KD组）包括SGC-7901-CLIC1-KD和MGC-803-CLIC1-KD,当细胞处于对数生长期时常规消化并制成单细胞悬液,每组随机选择6只裸鼠于BALB/C裸鼠前肢腋窝处注射0.2ml单细胞悬液（细胞数达到1×10~7个以上）,7天后裸鼠出现直径6mm左右的皮下结节,皮下瘤模型建立成功;而沉默CLIC1表达的MGC-803皮下瘤构建是通过重新合成靶向沉默CLIC1基因的经过特殊化学修饰的si RNA（chol-si RNA）,并应用于MGC-803皮下瘤的瘤内局部多次注射,获得了对应的皮下瘤MGC-803-CLIC1-chol,及其阴性对照组MGC-803-NC。2.HE染色观察皮下瘤形态,WES技术检测皮下瘤CLIC1蛋白的表达率。3.将各组瘤块在裸鼠间传代接种（一般2代）每组随机选择裸鼠6只。4.每组随机选择6只裸鼠,将瘤块种植于裸鼠胃壁浆膜下,构建人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。5.WES技术检测原位移植瘤CLIC1蛋白的表达率。结果:1.成功构建SGC-7901、SGC-7901-NC、SGC-7901-CLIC1-KD、MGC-803和MGC-803-NC1皮下瘤,但MGC-803-CLIC1-KD的皮下瘤构建失败,其替代者―MGC-803-CLIC1-chol构建成功,经检测其CLIC1抑制率达79%,可用于后续实验。2.HE染色证实皮下瘤为恶性肿瘤细胞。3.原代皮下瘤和2代皮下瘤成瘤速度均明显变慢（*P<0.05 KD/cholvs CON和NC）;成功建立裸鼠的人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。4.WES技术鉴定SGC-7901-CLIC1-KD和MGC-803-CLIC1-chol原位移植瘤瘤块的CLIC1蛋白抑制率分别为67%和87%,可用于后续实验。结论:成功构建各组人胃癌裸鼠皮下瘤模型,最后成功构建原位移植瘤模型。第二部分沉默表达CLIC1基因对人胃癌裸鼠原位移植瘤生物学行为的影响目的:探讨沉默表达CLIC1基因对人胃癌裸鼠原位移植瘤生长、代谢、凋亡及侵袭转移等生物学行为的影响。方法:测量各组原位移植瘤的体积和重量;应用TUNEL法检测沉默表达CLIC1基因前后各组原位移植瘤的凋亡情况;应用PET-CT技术扫描裸鼠并获得对应的%ID/g值以观察各组原位移植瘤原发灶的代谢情况,并观察有无转移灶;应用HE染色观察各组原位移植瘤模型裸鼠的器官和组织（肠及淋巴结）侵袭转移情况。结果1.沉默表达CLIC1组（SGC-7901-CLIC1-kd和MGC-803-CLIC1-chol）胃原位移植瘤的体积分别为（0.071±0.021）cm~3、（0.004±0.002）cm~3均低于CON组和NC组（F分别为37.27和4.740,P<0.05）,各CON组与NC组间差异无统计学意义（均P>0.05）。2.SGC-7901-CLIC1-kd和MGC-803-CLIC1-chol原位移植瘤瘤重分别为（0.387±0.108）g、（0.0350±0.0105）g均显著小于CON组和NC组（F分别为19.930和4.331,P<0.05）,各CON组与NC组间差异无统计学意义（均P>0.05）。3.SGC-7901-CLIC1-kd和MGC-803-CLIC1-chol原位移植瘤组的细胞凋亡情况显著高于CON组和NC组（P<0.05）,凋亡指数（Apoptosis Index,AI）分别为（19.420±3.360）%、（23.355±4.530）%均显著高于CON组和NC组（F分别为247.500和202.500,P<0.01）,各CON组与NC组间差异无统计学意义（均P>0.05）;普通染色凋亡指数分别为（21.920±8.380）%、（26.500±6.073）%均显著多于CON组及NC组（F分别为57.26和146.50,P<0.01）。各CON组与NC组间差异无统计学意义（均P>0.05）4.SGC-7901-CLIC1-kd和MGC-803-CLIC1-chol原位移植瘤的原发灶代谢情况即%ID/g值分别为（1.283±0.172）、（0.6915±0.1344）均显著弱于CON组及NC组（F分别为25.650和22.330,P<0.001）。5、SGC-7901-CLIC1-kd和MGC-803-CLIC1-chol原位移植瘤的淋巴转移数目分别为0颗、1颗均显著少于CON组及NC组（X~2分别为7.255和7.467,P<0.05）。另外,相较SGC-7901-CLIC1-kd和MGC-803-CLIC1-chol均未观察肠浸润（n=0）,SGC-7901系列中CON和NC组可观察到肠侵袭浸润情况（分别n=3例和n=5例,P=0.021）,MGC-803系列中CON和NC组可观察到肠侵袭浸润情况则（分别n=4例和n=4例,P=0.036）。结论:沉默CLIC1表达后抑制了原位移植瘤的生长、代谢及淋巴浸润的能力,同时促进了原位移植瘤的凋亡。第三部分沉默表达CLIC1基因抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤进展机制的体内研究目的:探讨沉默表达CLIC1抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤进展可能分子机制。方法:应用实时荧光定量PCR检测凋亡基因（Bcl-2、caspase-3）和整合素（Itergirn,ITG）（α1、α3、αv、β1）相关基因的表达情况,应用WES技术检测胃癌细胞中凋亡蛋白（Bcl-2、caspase-3、Bax）和整合素（α1、α3、αv、β1、β3）相关蛋白以及PI3K/Akt、MAPK/ERK、MAPK/p38通路蛋白的表达情况。应用免疫组化检测整合素（α1、α3、αv、β1、β3、β5）表达情况。结果:沉默表达CLIC1后胃原位移植瘤SGC-7901-CLIC1-KD组中Bcl-2和Caspase-3基因的相对表达量分别为（0.659±0.009）和（0.973±0.063）,MGC-803-CLIC1-chol组分别为（0.790±0.008）和（0.960±0.113）,相对于CON组和NC组Bcl-2表达均显著下调（均P<0.01）;而Caspase-3表达无显著改变（P>0.05）;Bcl-2在SGC-7901和MGC-803组中的表达抑制率分别为34.90%和22%。胃原位移植瘤SGC-7901-CLIC1-KD组在ITGα1、α3、αv和β1基因的相对表达量分别为（1.518±0.132）、（0.633±0.045）、（0.558±0.089）和（0.603±0.081）,与CON相比ITGα1的m RNA表达上升了50.20%,ITGα1α3、αv和β1分别降低了36.670%、44.270%、39.770%（均P<0.05）。MGC-803-CLIC1-chol组分别为（1.417±0.053）、（0.705±0.031）、（0.861±0.024）和（0.616±0.062）,与CON相比ITGα1α1的m RNA表达上升了41.730%;α3、αv和β1分别降低了30.83%、13.97%、38.47%（均P<0.05）。沉默表达CLIC1后胃原位移植瘤SGC-7901-CLIC1-KD组中Bcl-2、Bax和Caspase-3的相对蛋白表达量的分别为（0.062±0.003）、（0.264±0.006）和（0.061±0.010）,MGC-803-CLIC1-chol组分别为（0.048±0.002）（0.175±0.009）和（0.061±0.010）,相对于CON组和NC组Bcl-2和Caspase-3表达均下调、Bax表达均上调（均P<0.05）;Bcl-2在KD组中的表达抑制率分别为41.50%和54.71%,Caspase-3则为62.58%和71.18%,Bax的表达增长率分别为120%和200%。SGC-7901-CLIC1-KD组在抑制CLIC1表达后ITGα1、α3、αv、β1和β3的相对表达量分别为（0.582±0.080）、（0.076±0.017）、（0.082±0.012）、（0.077±0.002）和（0.051±0.014）,MGC-803-CLIC1-chol组分别为（0.607±0.109）、（0.049±0.016）、（0.067±0.010）、（0.049±0.007）和（0.038±0.002）。与CON组和NC组相比,ITGα1表达均上调,α3、αv、β1和β3表达均下调（均P<0.05）。ITGα1的蛋白在KD组中表达分别上升了1.16倍和1.13倍,ITGα3表达抑制率分别为55.29%和66.89%,ITGαv则分别为86.03%和86.43%,ITGβ1则分别为33.62%和43.02%,ITGβ3则分别为48.49%和42.22%（均P<0.05）。沉默表达CLIC1后胃原位移植瘤SGC-7901-CLIC1-KD组中p-AKT、AKT、p-p38、p38、p-ERK和ERK的相对蛋白表达量的分别为（0.058±0.018）、（0.163±0.016）、（0.120±0.004）、（0.131±0.027）、（0.073±0.013）和（0.159±0.019）,MGC-803-CLIC1-chol组分别为（0.041±0.008）、（0.164±0.006）、（0.211±0.015）、（0.133±0.009）、（0.062±0.011）和（0.134±0.016）,相对于CON组和NC组p-AKT和p-ERK表达均下调、p-p38表达均上调（均P<0.05）;而AKT、p38和ERK的表达均无明显变化（均P>0.05）。p-AKT在KD组中的表达抑制率分别为36.96%和47.44%,p-ERK则为46.32%和53.03%,p-p38的表达增长率分别为88.89%和151%。免疫组化的结果显示:抑制CLIC1表达后胃原位移植瘤中ITGα1、α3、αv、β1、β3和β5均可见表达,可见β5亦是有表达的（RT-PCR和WES检测均未见明显表达）。通过观察结果,与CON组和NC组相比,抑制CLIC1表达后胃原位移植瘤中α1表达趋势是上调的,、αv、β1、β3和β5表达趋势是下调的。结论:在沉默表达CLIC1后,部分整合素家族和凋亡家族的基因、蛋白发生差异性改变,同时发现Akt和MAPK通路发生了改变。因此,我们推断:CLIC1沉默后原位移植瘤进展能力减弱（生长增殖减慢、代谢减弱、凋亡增加及侵袭能力减弱）的机制可能与胃癌细胞整合素家族蛋白（ITGα1、α3、αv、β1及β3等）发生差异性表达,通过Akt、MAPK通路发生序贯反应,最终影响胃癌进展有关。