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气道重构是多种慢性肺气道疾病(如哮喘、慢性阻塞性肺炎)的主要病理特征,包括气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)、上皮细胞、腺体细胞、血管细胞和细胞外基质的改变。细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),也存在于烟雾、粉尘中,可诱导气道重构,但机制并不完全明了。乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)是气道中重要的副交感神经递质,除神经细胞外,ASMCs及气道上皮细胞等也可分泌ACh。大量文献表明除收缩作用外,ACh可能与气道炎性及气道重构有一定关系。经典瞬时受体电位通-3(canonical transient receptor potential channel-3,TRPC3)编码天然固有活性的非选择性阳离子通道(nonselective cation channels,NSCCs),通过介导胞内钙浓度的变化,在ASMCs的收缩及气道高反应性中发挥重要作用,但是其在气道重构中的作用尚不清楚。因此,本课题中,我们分别采用LPS及ACh作为工具药刺激原代小鼠ASMCs增殖,探讨TRPC3在ASMCs增殖中的作用,为探寻干预气道重构的靶点提供依据。第一部分TRPC3在LPS诱导气道平滑肌细胞增殖中的作用目的:探讨TRPC3在LPS诱导小鼠ASMCs增殖中的作用及可能机制。方法:原代培养小鼠ASMCs,采用MTT法检测小鼠ASMCs增殖程度,Western blot检测小鼠ASMCs中TRPC3蛋白的表达变化,钙影像检测小鼠ASMCs内钙浓度([Ca2+]i)变化,全细胞膜片钳检测小鼠ASMCs中NSCC电流变化,si RNA转染沉默小鼠ASMCs的TRPC3基因。结果:(1)LPS(0.1-10μg/ml)作用ASMCs 24 h和48 h,均可剂量依赖性地促ASMCs胞增殖,LPS(10μg/ml,48 h)作用更加明显;非选择性TRPC3阻断剂Gd Cl3(3μM)和TRPC3抗体(1:200)均可明显抑制LPS促ASMCs增殖作用。(2)LPS可明显使ASMCs中TRPC3表达水平、NSCC电流幅度增高;Gd Cl3可显著抑制LPS诱导的TRPC3蛋白上调,Gd Cl3及TRPC3抗体均可明显抑制LPS诱导的NSCC电流增加。(3)Gd Cl3可明显抑制急性给予LPS对ACh(100μM)诱导ASMCs钙反应的升高作用;LPS(10μg/ml,48 h)预处理ASMCs,可明显使静息[Ca2+]i及ACh诱导的ASMCs钙反应增加,Gd Cl3及TRPC3抗体均可明显抑制这种作用。(4)TRPC3si RNA(30μM,72h)转染可使ASMCs的TRPC3蛋白表达下降约70%,也可显著抑制正常ASMCs增殖及LPS促ASMCs增殖作用。(5)TRPC3si RNA转染可明显抑制LPS诱导TRPC3蛋白表达增高及NSCC电流增加。(6)TRPC3si RNA转染可明显抑制LPS预处理诱导的静息[Ca2+]i及ACh诱导ASMCs钙反应升高作用。小结:该部分研究发现LPS可明显促进ASMCs增殖,同时可明显使TRPC3蛋白表达及NSCC电流幅度增高,促进ASMCs静息[Ca2+]i及ACh诱发的钙反应升高;且这些效应可被Gd3+、TRPC3抗体或TRPC3基因沉默所抑制。表明:LPS可能通过上调TRPC3蛋白表达及其编码的NSCC电流增加,诱导[Ca2+]i升高,最终促进ASMCs增殖。第二部分TRPC3在ACh诱导气道平滑肌细胞增殖中的作用目的:探讨TRPC3在ACh诱导小鼠ASMCs增殖中的作用及潜在机制。方法:原代分离培养小鼠ASMCs,分别用MTT法检测小鼠ASMCs活性,Western blot检测小鼠ASMCs中TRPC3蛋白表达变化,钙影像检测小鼠ASMCs内钙([Ca2+]i)变化,全细胞膜片钳检测小鼠ASMCs中NSCC电流变化,si RNA转染沉默小鼠ASMCs的TRPC3基因。结果:(1)ACh(0.001-1000μM)作用ASMCs 24 h和48 h,可时间、剂量依赖性地促ASMCs增殖,ACh(100μM,24 h)作用比较明显;非选择性TRPC3阻断剂Gd Cl3(3μM)和TRPC3抗体(1:200)均可明显抑制ACh促ASMCs增殖作用。(2)ACh可明显使TRPC3表达水平及NSCC电流幅度升高,Gd Cl3可显著抑制ACh诱导TRPC3蛋白表达上调;Gd Cl3及TRPC3抗体可明显抑制ACh诱导的NSCC电流增加。(3)Gd Cl3可明显抑制急性给予ACh对KCl(100 m M)诱导钙反应的升高作用;ACh(100μM,24h)预处理可明显使静息[Ca2+]i及KCl诱导的ASMCs钙反应增加,Gd Cl3及TRPC3抗体均可显著抑制ACh的作用。(4)TRPC3si RNA(30μM,72 h)转染可使TRPC3蛋白表达下降约70%,也可显著抑制ACh促ASMCs增殖作用及正常情况下ASMCs增殖作用。(5)TRPC3si RNA转染可明显抑制ACh诱导ASMCs中TRPC3蛋白表达增高及NSCC电流增加。(6)TRPC3si RNA转染可明显拮抗ACh预处理引发的静息[Ca2+]i升高及KCl诱导钙电流升高。小结:通过该部分研究发现:ACh预处理ASMCs可明显促进其增殖,并通过上调TRPC3表达、升高NSCC电流,进而导致ASMCs静息[Ca2+]i及KCl诱发的钙反应升高;而ACh的这些效应可被Gd3+、TRPC3抗体或TRPC3基因沉默所抑制。表明:ACh可能通过上调TRPC3表达,增大其介导的NSCC电流,导致[Ca2+]i升高,进而发挥促ASMCs增殖作用。结论:TRPC3介导的[Ca2+]i变化在LPS及ACh诱导ASMCs增殖中均发挥重要作用,可能是干预气道重构的潜在靶点。