背景:脓毒血症（sepsis）是最为常见的全身性炎症疾病之一,主要是革兰氏阴性菌进入机体后,在机体血液循环中释放大量的内毒素引起。内毒素引起全身性炎症疾病的化学成分主要是脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,LPS通过机体细胞膜上多种不同的信号受体将有害刺激信号转入细胞内,进而启动宿主的天然免疫防御反应,但是持续大量的LPS刺激可能会引起机体免疫反应紊乱,从而导致机体器官组织损伤。全身性脓毒血症可引起机体的炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,SIRS如果没有得到及时的、有效的治疗,将会进一步恶化成为多器官功能的衰竭,其中心脏是脓毒血症主要靶器官之一。脓毒血症患者如果出现心脏的并发症,其病情将会急剧恶化,死亡率可高达50%～60%,由此可见心脏功能障碍是加快脓毒血症患者死亡的重要原因之一。超声心动图也显示部分早期脓毒血症患者已经出现左心室扩张和左室射血分数下降,这一结果进一步表明早期脓毒血性患者可能已经存在心功能不全。现如今,临床研究学者与医护人员已经普遍认识到心功能不全与脓毒血症患者的预后密切相关,因此,改善心脏功能状态对于降低脓毒血症患者的死亡风险具有至关重要的作用。但是目前针对脓毒血症引起的心脏损害的治疗并不理想,其主要原因是脓毒血症诱导的心功能障碍的机制并不十分明确,因此发现脓毒血症诱导的心功能障碍的特异性分子以及信号通路,对于寻找新的治疗靶点具有非常重要的临床意义。CDKN1A是细胞周期蛋白依赖激酶（Cyclin-dependent kinases CDKs）抑制分子Cip/Ki家族中的重要成员之一,又名为p21WAF1/CIP1（下文中均用p21表示）,同时也是肿瘤抑制因子p53的重要下游靶点。顾名思义,p21参与细胞周期的调控,它能抑制周期素蛋白、CDK以及周期素蛋白/CDK两者形成的复合物,也可与细胞核内的增殖细胞核抗原相互结合。此外,p21在细胞衰老与细胞凋亡中也发挥着一定作用。哺乳动物中,胚胎以及新生儿心脏中p21的表达水平较低,但在成年心脏中表达丰富。大量研究表明p21参与了心肌损伤的病理过程,但目前关于p21在心血管疾病中的表达水平的改变及其意义存在争议。p21的表达改变在心肌肥厚动物模型中并不一致,其相应的角色也存在着争议。在血管紧张素II（Angiotensin II,Ang II）诱导的小鼠心脏肥厚中,p21的表达水平是降低的,但在其他多种心肌肥厚模型中,如自发性高血压大鼠以及异丙肾上腺素刺激诱导的心肌肥厚,心肌组织中p21的表达水平却是持续增加。p21在阿霉素诱导的心脏毒性中的表达情况与心肌肥厚相似,具有两面性,这可能与心肌受到病理刺激的持续时间以及损伤程度不同相关。近来有研究报道,不依赖于细胞周期调控作用,p21在炎症性疾病中发挥着重要作用,但是p21与脓毒血症诱导的心功能障碍的研究尚未见报道。p21的作用机制非常复杂,在不同的细胞类型以及不同的刺激条件下作用机制不同,且尚未完全阐明。本研究拟应用p21基因敲除小鼠研究p21在LPS诱导的心功能障碍中的作用及其机制,以探索防治脓毒血症诱导的心功能障碍的新靶点和新策略。方法:第一部分:小鼠在体实验:采用年龄为8-12周大小,体重为25-27克左右的C57BL/6雄性小鼠,于小鼠腹腔内注射非致死剂量的LPS（5 mg/kg）,建立小鼠脓毒血症模型。将C57BL/6野生型雄性小鼠随机分成4组,分别是生理盐水对照组、LPS注射6小时组、LPS注射24小时组和LPS注射48小时组,于相应的LPS刺激时间点取心脏组织,采用实时荧光定量PCR与蛋白免疫印迹Western Blot的方法分别检测各组小鼠心肌组织中p21 m RNA与蛋白的表达水平,采用免疫组化的方法检测p21在心肌组织中的表达部位。细胞离体实验:提取大鼠原代心肌细胞作为实验的对象,随机分为6组:PBS组（PBS组）、LPS刺激1小时组、LPS刺激3小时组、LPS刺激6小时组、LPS刺激12小时组和LPS刺激24小时组,刺激组分别给予10μg/m L的LPS,于刺激完后的相应时间点取材原代心肌细胞,采用实时荧光定量PCR与蛋白免疫印迹Western Blot的方法分别检测各组原代心肌细胞中p21 m RNA与蛋白的表达水平,采用心肌肌动蛋白α-actin与p21的免疫荧光双染色以确定心肌细胞内p21的表达分布以及LPS刺激后p21分布的改变。第二部分小鼠在体实验:采用年龄为8-12周大小,体重为25-27克左右的C57BL/6野生型雄性小鼠与p21基因敲除的雄性小鼠,腹腔内注射LPS（5 mg/kg）建立小鼠脓毒血症模型,分别将C57BL/6小鼠与p21基因敲除小鼠随机分为对照组、LPS腹腔注射6小时组、LPS腹腔注射24小时组和LPS腹腔注射48小时组,于LPS刺激的相应时间点进行超声心动图检测以评估心功能,超声检查后进行心脏组织的取材,采用实时荧光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中促炎因子、氧化应激相关酶以及能量代谢相关因子的表达水平,采用超氧化物歧化酶（SOD）的检测试剂盒与丙二醛（MDA）的检测试剂盒,分别检测各组心脏组织中SOD酶的活性以及MDA的含量,采用透射电子显微镜用来观察心肌组织中线粒体的结构。细胞离体实验:用重组的腺病毒载体将p DKD-CMV-MCS-U6-sh RNA（p21靶点）进行包装后（sh-p21）,感染大鼠原代心肌细胞,将p21进行体外沉默,空白载体包装的腺病毒作为阴性对照（sh-NC）;将感染腺病毒的细胞分为PBS组,LPS刺激组（6 h组与24 h组）,LPS刺激组分别给予10μg/m L的LPS。采用实时荧光定量PCR的方法检测各组心肌细胞中的促炎因子和氧化应激相关酶的表达水平,采用活性氧的试剂盒用来检测心肌细胞内活性氧的表达改变,采用JC-1线粒体荧光染色检测心肌细胞中线粒体膜电位的改变。第三部分小鼠在体实验:采用年龄为8-12周大小,体重为25-27克左右的C57BL/6野生型雄性小鼠与p21基因敲除的雄性小鼠,腹腔内注射LPS（5 mg/kg）建立小鼠脓毒血症模型,分别将C57BL/6小鼠与p21基因敲除小鼠随机分为对照组、LPS腹腔注射6小时组、LPS腹腔注射24小时组和LPS腹腔注射48小时组,Western Blot用来检测转录因子NF-κB p65、抗氧化蛋白Nrf2、凋亡执行蛋白cleaved-caspase 3、细胞周期素蛋白激酶CDK2、自噬小体膜蛋白LC3、自噬底物蛋白p62以及溶酶体关联膜蛋白LAMP1的表达水平,采用透射电子显微镜用来动态观察心肌组织中自噬小体的改变。细胞离体实验:构建用腺病毒包装的p21沉默载体（sh-p21）以及阴性对照载体（sh-NC）,在转染sh-p21和sh-NC腺病毒的原代大鼠心肌细胞中,分别给予PBS或LPS刺激,LPS刺激组（6 h组与24 h组）分别给予10μg/m L的LPS,蛋白免疫印迹Western Blot检测LC3和p62的表达水平,免疫沉淀检测p21与LC3之间的相互作用,采用LC3与p21的免疫荧光双染色以确定心肌细胞内p21与LC3的表达分布。此外,在p21敲除小鼠与sh-p21转染的原代心肌细胞中,LPS刺激后加入自噬激动剂雷帕霉素检测小鼠心功能、心肌细胞炎症与氧化应激水平。结果第一部分:1.在LPS诱导的脓毒血症小鼠模型中,LPS刺激6 h、24 h和48 h后,小鼠心肌组织中p21 m RNA与蛋白水平均明显高于对照组,LPS刺激6 h时,p21m RNA的表达水平最高;LPS刺激24 h时,p21蛋白表达水平达峰值;LPS刺激后p21在细胞质与胞核中的表达均增加;2.原代大鼠心肌细胞给予LPS刺激后,p21 m RNA与蛋白水平均明显高于对照组。第二部分:1.超声结果显示,LPS刺激6 h,24 h和48 h时,p21基因敲除小鼠较野生型小鼠心功能恶化更为显著,表现为左室射血分数和短轴缩短率显著减少,左室收缩末内径明显增宽,p21 KO小鼠较WT小鼠心功能恢复时间明显延长;2.LPS刺激24 h与48 h后,p21基因敲除小鼠心肌组织中的线粒体损伤数量较野生型小鼠显著增加;LPS刺激6 h和24 h时,沉默腺病毒sh-p21感染的原代心肌细胞中,线粒体膜电位改变更为明显;3.LPS刺激后,与对照组相比,p21基因敲除小鼠心肌组织与沉默腺病毒sh-p21感染的原代心肌细胞的炎症反应更为明显,表现为促炎因子TNFα、IL6和MCP1的m RNA表达水平显著增加;4.LPS刺激后,与对照组相比,p21基因敲除小鼠心肌组织与沉默腺病毒sh-p21感染的原代心肌细胞的氧化应激反应显著增加,p21基因敲除小鼠较野生型小鼠,其心肌组织中SOD2 m RNA水平和SOD酶活性明显降低,NOX2 m RNA水平和MDA含量增加;沉默腺病毒sh-p21感染的原代心肌细胞中ROS的含量更高;5.LPS刺激6 h后,p21基因敲除小鼠与野生型小鼠心肌能量代谢相关蛋白（CD36、MCAD、PPARα和GLUT4）转录水平无明显差异。第三部分:1.相较于野生型小鼠,p21基因敲除小鼠在LPS刺激后,心肌组织中NF-κB p65的活性增强,Nrf2、c-caspase3与CDK2的表达未见明显变化;2.LPS刺激后,p21缺失使小鼠心肌组织与原代心肌细胞的自噬水平明显降低,表现为LC3II的蛋白表达明显减少,p62的蛋白聚集明显增多,自噬小体数量明显减少;3.LPS刺激后,p21基因敲除小鼠心肌组织中自噬上游激酶AMPKα,AKT以及MAPK p38信号通路的表达与野生型小鼠相比,未见明显差异;4.基础状态下,原代心肌细胞中p21可以LC3结合,LPS刺激后,p21与LC3的结合显著增加;5.感染p21沉默腺病毒的原代心肌细胞加入自噬激动剂雷帕霉素后,LPS刺激24 h后增加的促炎因子和促氧化酶m RNA的表达水平明显降低。6.经雷帕霉素处理的p21基因敲除小鼠,LPS刺激24 h后,其心功能较未经处理的小鼠得到明显改善。结论:（1）LPS刺激后,小鼠心肌组织与原代大鼠心肌细胞中p21的表达水平增加;（2）p21缺失促进心功能恶化、炎症和氧化应激反应;（3）p21通过调控LC3发挥心肌保护作用。