论文部分内容阅读
背景:脓毒症是指由感染引起的复杂的全身性炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS）。由于脓毒症的高致死率,临床医生越来越重视脓毒症带来的炎症因子风暴以及其他重要器官并发症。脓毒症诱发的心肌病（Sepsis induced cardiomyopathy,SIC）是脓毒症患者的严重并发症并可引起患者短期内死亡。近年来,随着科学研究的不断深入和技术手段的不断开发,人们对SIC的病理过程有了新的认识。然而,SIC的具体机制尚未完全阐明。高迁移率族（High mobility group,HMG）蛋白是指参与细胞染色质重塑的非组蛋白超家族。据报道,HMGA1作为HMG的成员,在具有高度恶性增殖能力的人宫颈癌Hela细胞中首次被发现。HMGA1在多种生物胚胎发生过程中高表达,在正常组织中几乎没有表达。HMGA1蛋白通过位于其氨基末端区域的独特功能基序（称为“AT-hooks”）与富含AT序列的DNA小沟结合,改变染色质结构并募集转录因子。通过与DNA和转录因子的相互作用,HMGA1参与了许多基本细胞生物学过程的调控。此外,既往研究报道HMGA1还参与多种心血管疾病病理过程的调节,包括冠状动脉微栓塞诱导的心肌炎,心肌梗死和心肌肥厚等。然而,HMGA1在SIC中的确切作用仍不清楚。在本研究中,我们构建了脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱发的小鼠心肌炎症模型和LPS刺激的H9c2心肌细胞炎症模型,采用携带野生型HMGA1基因的腺相关病毒9型（AAV9-HMGA1）心肌内注射构建心脏特异性HMGA1过表达的小鼠,以及体外AAV9-HMGA1和si-HMGA1转染H9c2细胞探讨HMGA1在SIC中的作用及其致病机制,以期为SIC的防治提供理论基础和新的思路。方法:第一部分:探讨HMGA1在LPS诱导的心肌炎症中的表达及意义动物实验:C57BL/6雄性小鼠采用随机数字列表法分为两组:LPS组和对照（Control,Con）组。LPS组给予单次腹腔注射剂量为6mg/kg的LPS,Con组给予腹腔注射等体积的无菌生理盐水;6小时后进行小鼠心脏组织的取材。采用蛋白免疫印迹（Western Blot）检测心脏组织中的HMGA1表达水平,采用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测心脏组织中HMGA1的转录水平,采用免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）检测HMGA1在心肌细胞中的定位及表达。细胞实验:采用H9c2大鼠心肌细胞株进行体外实验,随机分为两组:LPS组和对照（Control,Con）组。LPS组给予LPS（1μg/ml）刺激,Con组给予等体积的磷酸缓冲盐溶液（PBS）处理;12小时后收集H9c2细胞。提取蛋白采用蛋白免疫印迹（Western Blot）检测H9c2心肌细胞中的HMGA1表达水平,采用RT-PCR检测H9c2心肌细胞中HMGA1的转录水平,采用免疫荧光染色检测HMGA1在H9c2心肌细胞中的定位及表达。第二部分:HMGA1在LPS诱导的心肌炎症中的作用动物实验:C57BL/6雄性小鼠采用随机数字列表法随机分为4组:AAV9-GFP对照组（AAV9-GFP+Saline）、AAV9-HMGA1过表达对照组（AAV9-HMGA1+Saline）、AAV9-GFP+LPS组（AAV9-GFP+LPS）和AAV9-HMGA1+LPS组（AAV9-HMGA1+LPS）;AAV9-GFP+Saline组和AAV9-HMGA1+Saline组分别给予AAV9-GFP和AAV9-HMGA1心肌内多点注射,1周后给予腹腔生理盐水注射;AAV9-GFP+LPS和AAV9-HMGA1+LPS组分别给予AAV9-GFP和AAV9-HMGA1心肌内多点注射,1周后给予LPS单次腹腔注射;LPS注射6小时后超声心动图检测心功能以及小鼠心脏组织取材进行后续病理学检测和分子生物学检测。RT-PCR检测心肌炎症因子的m RNA水平以评估小鼠心肌组织炎症水平,采用末端转移酶介导的d UTP末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡水平,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。细胞实验:1、将H9c2心肌细胞随机分为4组:AAV9-GFP对照组（AAV9-GFP+PBS）、AAV9-HMGA1过表达对照组（AAV9-HMGA1+PBS）、AAV9-GFP+LPS组（AAV9-GFP+LPS）和AAV9-HMGA1+LPS组（AAV9-HMGA1+LPS）;AAV9-GFP+PBS组和AAV9-HMGA1+PBS组分别给予AAV9-GFP和AAV9-HMGA1转染后给予PBS处理;AAV9-GFP+LPS和AAV9-HMGA1+LPS组分别给予AAV9-GFP和AAV9-HMGA1转染后给予LPS刺激12小时。CCK8检测各组细胞的活力,RT-PCR检测H9c2心肌细胞炎症因子的m RNA水平以评估细胞炎症反应,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。2、将H9c2心肌细胞随机分为4组:si-NC对照组（si-NC+PBS）、si-HMGA1沉默对照组（si-HMGA1+PBS）、si-NC+LPS组（si-NC+LPS）和siHMGA1+LPS组（si-HMGA1+LPS）;si-NC+PBS组和si-HMGA1+PBS组分别给予si-NC和si-HMGA1转染后给予PBS处理;si-NC+LPS和si-HMGA1+LPS组分别给予si-NC和si-HMGA1转染后给予LPS刺激12小时。CCK8检测各组细胞的活力,RT-PCR检测各组H9c2心肌细胞炎症因子的m RNA水平以评估细胞炎症反应,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。第三部分:HMGA1在LPS诱导的心肌炎症中的作用机制细胞实验:1、将H9c2心肌细胞随机分为4组:AAV9-GFP对照组（AAV9-GFP+PBS）、AAV9-HMGA1过表达对照组（AAV9-HMGA1+PBS）、AAV9-GFP+LPS组（AAV9-GFP+LPS）和AAV9-HMGA1+LPS组（AAV9-HMGA1+LPS）;AAV9-GFP+PBS组和AAV9-HMGA1+PBS组分别给予AAV9-GFP和AAV9-HMGA1转染后给予PBS处理;AAV9-GFP+LPS和AAV9-HMGA1+LPS组分别给予AAV9-GFP和AAV9-HMGA1转染后给予LPS刺激12小时。RT-PCR检测心肌细胞信号转导子和转录激活子3（Signal transducer and activators of transcription 3,STAT3）和环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）的转录水平,Western Blot检测心肌细胞的p-STAT3（Tyr705）,STAT3和COX-2的蛋白表达水平。2、将H9c2心肌细胞随机分为4组:si-NC对照组（si-NC+PBS）、si-HMGA1沉默对照组（si-HMGA1+PBS）、si-NC+LPS组（si-NC+LPS）和si-HMGA1+LPS组（si-HMGA1+LPS）;si-NC+PBS组和si-HMGA1+PBS组分别给予si-NC和siHMGA1转染后给予PBS处理;si-NC+LPS组和si-HMGA1+LPS组分别给予siNC和si-HMGA1转染后给予LPS刺激12小时。RT-PCR检测心肌细胞STAT3和COX-2的转录水平,Western Blot检测心肌细胞的p-STAT3（Tyr705）,STAT3和COX-2的蛋白表达水平。3、将H9c2心肌细胞随机分为4组:空白对照组（PBS）、LPS组（LPS）、LPS+AAV9-HMGA1组（LPS+AAV9-HMGA1）和LPS+AAV9-HMGA1+celecoxib组（LPS+AAV9-HMGA1+celecoxib）;空白对照组给与PBS处理,LPS组给与LPS刺激12小时,LPS+AAV9-HMGA1组给予AAV9-HMGA1转染后给予LPS刺激12小时,LPS+AAV9-HMGA1+celecoxib组给予AAV9-HMGA1转染后给予celecoxib处理12小时后加入LPS刺激12小时。4、将H9c2心肌细胞随机分为4组:空白对照组（PBS）、LPS组（LPS）、LPS+siHMGA1组（LPS+si-HMGA1）和LPS+si-HMGA1+colivelin组（LPS+siHMGA1+colivelin）;空白对照组给与PBS处理,LPS组给与LPS刺激12小时,LPS+si-HMGA1组给予si-HMGA1转染后给予LPS刺激12小时,LPS+siHMGA1+colivelin组给予si-HMGA1转染后给予colivelin处理12小时后加入LPS刺激12小时。结果:第一部分:HMGA1在LPS诱导的SIC小鼠心脏组织和LPS刺激的H9c2心肌细胞中表达明显增高,并且HMGA1主要表达在心肌细胞核中。第二部分:1.在腹腔注射LPS六小时后,心脏超声检测结果显示,AAV9-GFP+LPS组小鼠的左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和左室短轴缩短率（Left ventricular fractional shortening,LVFS）降低,左心室收缩末期内径（Left ventricular end-systolic diameter,LVESd）升高,心率（Heart rate,HR）和左心室舒张末期内径（Left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd）无明显改变;提示小鼠心功能恶化。HMGA1过表达则进一步加剧了LPS引起的小鼠心功能障碍。2.RT-PCR结果显示AAV9-GFP+LPS组小鼠心脏组织炎症细胞因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）,白细胞介素-1（Interleukin-1,IL-1）白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）的m RNA水平明显增高,HMGA1过表达则进一步加剧了LPS引起的小鼠心脏炎症水平。3.TUNEL心脏组织切片染色显示AAV9-GFP+LPS组小鼠心脏组织TUNEL阳性细胞数目增多;同时,免疫印迹检测显示AAV9-GFP+LPS组促凋亡蛋白Bax和细胞色素C（Cytochrome C）升高,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低;HMGA1过表达则进一步加剧了LPS引起的小鼠心肌细胞凋亡。4.CCK8结果显示AAV9-GFP+LPS组H9c2心肌细胞活力下降,HMGA1过表达加剧了细胞活力的降低;RT-PCR结果显示AAV9-GFP+LPS组H9c2心肌细胞炎症细胞因子的转录水平上升,HMGA1过表达进一步加剧了细胞的炎症水平;TUNEL染色表明AAV9-GFP+LPS组H9c2心肌细胞凋亡数目增加,免疫蛋白印迹显示AAV9-GFP+LPS组H9c2心肌细胞促凋亡蛋白升高,而抑凋亡蛋白表达降低,HMGA1过表达则进一步加剧了LPS引起的H9c2心肌细胞凋亡。5.CCK8结果显示si-NC+LPS组H9c2心肌细胞活力下降,HMGA1沉默加剧了细胞活力的降低;RT-PCR结果显示si-NC+LPS组H9c2心肌细胞炎症细胞因子的转录水平上升,HMGA1沉默缓解了LPS诱导的细胞炎症;TUNEL染色表明si-NC+LPS组H9c2心肌细胞凋亡数目增加,免疫蛋白印迹显示si-NC+LPS组H9c2心肌细胞促凋亡蛋白升高,而抑凋亡蛋白表达降低,HMGA1沉默则进一步加剧了LPS引起的H9c2心肌细胞凋亡。第三部分:1.AAV9-GFP+LPS组心肌细胞中p-STAT3（Tyr705）,STAT3和COX-2的蛋白表达水平升高,HMGA1过表达促进了LPS诱导的COX-2表达的增加;但是对STAT3蛋白和转录水平均无影响。2.si-NC+LPS组心肌细胞的p-STAT3（Tyr705）,STAT3和COX-2的蛋白表达水平升高,HMGA1沉默抑制了LPS诱导的p-STAT3（Tyr705）和STAT3表达的增加;但是对COX-2蛋白和转录水平均无影响。3.COX-2抑制剂可以逆转HMGA1过表达导致的H9c2心肌细胞炎症因子转录水平的上升和凋亡阳性细胞数目的增多。而STAT3激动剂可以逆转HMGA1沉默介导的H9c2心肌细胞炎症因子转录水平的降低和凋亡阳性细胞数目的增多。结论:1.在LPS诱导的小鼠心脏组织和LPS刺激的H9c2心肌细胞中HMGA1的表达明显增高。2.HMGA1过表达加剧LPS诱导的小鼠心功能恶化,心脏组织炎症和心肌细胞凋亡。3.HMGA1过表达加剧LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症和凋亡。4.HMGA1沉默缓解LPS诱导的H9c2心肌细胞炎症,但加剧了细胞凋亡。5.HMGA1的过表达通过上调COX-2的表达而加重心肌细胞的炎症和凋亡;而HMGA1沉默则通过抑制STAT3的表达,减轻细胞炎症并加剧细胞凋亡。