脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,由于其在细菌裂解死亡后大量释放又被称为细菌内毒素。常见的革兰氏阴性菌有霍乱弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌及布鲁氏菌等,革兰氏阴性菌可引起动物及人类消化道、生殖系统及血液等传染病及人畜共患病,严重影响了畜牧业的发展和人类的健康。当病原体侵染动物体内后会激发细胞的天然免疫反应,Toll样受体（Toll-like receptors）可以有效识别多种病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）激发相应免疫应答。其中,TLR4主要识别革兰氏阴性菌细胞壁的表面抗原LPS,通过相关途径激活NF-κB促进炎症因子的释放,进而提高获得性免疫应答。实验室为验证TLR4在炎症反应中的作用,已构建3s-pIL6-TLR4真核表达载体,并通过转染绵羊成纤维细胞验证其功能。通过外源目的片段原核显微注射的方法生产pIL6-TLR4转基因绵羊。对39只绵羊进行Southern鉴定,得到四只转基因阳性个体。通过分离绵羊外周血单核细胞,使用沙门氏菌侵染（MOI=100）,探究转基因绵羊和野生型绵羊对沙门氏菌胞内寄生的影响。首先利用荧光定量PCR技术检测TLR4 m RNA的表达量。同时,检测在机体炎症反应过程中具有不同生理功能的细胞因子（IL6、TNF-α、IL-8、IL-10、IFN-γ）m RNA的表达量,利用ELISA技术检测TLR4蛋白表达量。然后检测相关氧化应激指标（NOS、NO、GSH、GSSG、ROS、MDA）来评价氧化损伤程度。最后对攻菌后的细胞进行DAPI和PI染色,对比转基因绵羊和野生型绵羊的外周血单核细胞的死亡情况,同时比较两组羊单核细胞胞内含菌量的情况。通过分析两组数据发现,在24 h和48 h转基因绵羊胞内含菌量少于非转基因绵羊,且差异显著（p<0.05）。转基因绵羊TLR4 m RNA在4 h时表达量达到高峰,IL-6、TNF-α、IL-8、IFN-γ的m RNA在4 h、12 h、24 h均显著高于非转基因绵羊（p<0.05）,抑炎因子IL-10在炎症反应后期开始上调表达,同时抑制促炎因子和炎症因子的表达。在沙门氏菌刺激下,转基因绵羊比非转基因绵羊更早促发了炎症因子的早表达和高表达,同时也触发了抗炎因子的早表达和高表达,是一种高氧化水平与高还原水平并存,并保护细胞免受损伤的状态。通过DAPI和PI染色并使用高内涵分析（High Content Analysis,简称HCA）统计分析两组数据,转基因绵羊和野生型绵羊外周血单核细胞死亡率没有显著差异。对39只绵羊进行Southern鉴定,得到四只转基因阳性个体,成功的构建了过表达TLR4转基因绵羊。并通过沙门氏菌侵染绵羊外周血单核细胞,实验结果表明转基因绵羊通过上调TLR4 m RNA和蛋白质的表达量,进而上调了IL6、IL8、IL10、TNF-α、IFN-γ等炎症因子和NO、ROS、GSH等氧化应激因子的表达量,进一步验证了外源目的基因有效整合到了绵羊基因组,并可以进行转录翻译,激活下游信号通路使下游细胞因子转录。通过沙门氏菌侵染绵羊外周血单核细胞实验,验证了绵羊外周血单核细胞可以有效抑制沙门氏菌细胞内寄生,增强了外周血单核对沙门氏菌杀伤能力,在细胞水平上验证了转基因绵羊可以有效地抑制沙门氏菌的胞内寄生。