猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害全球养猪行业的重要动物疫病,每年给全球养殖业带来重大经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是变异最快的RNA病毒之一,自1995年首次在中国发现以来,PRRSV在中国的流行范围不断扩大,并且形成多种基因型与亚型共存的现状。新型PRRSV变异株的频繁出现,给PRRS防控带来巨大压力。针对上述问题,本文开展了以下研究工作。一、建立了新型的通用及四重PRRSV荧光定量RT-PCR方法,可对临床样品进行高效的鉴别检测。二、通过该检测方法,发现两株基因组高度同源但临床发病情况完全不同的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)变异毒株。动物攻毒试验证实其致病力存在显著差异,并通过全基因序列分析发现了氨基酸差异位点。三、构建并拯救了上述两株高度同源的HP-PRRSV变异株感染性克隆病毒,为进一步探究与致病力相关的关键位点提供了有效的技术平台。研究1.通用及四重PRRSV荧光定量RT-PCR方法建立为了建立高效便捷的PRRSV鉴别检测方法,本研究基于探针与引物结合的方法设计2对引物和1条通用探针用于鉴别检测欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV;同时设计4对引物和4条探针用于鉴别不同基因型与亚型PRRSV。通过优化检测体系和程序,建立了特异性强,敏感度高,重复性良好的PRRSV通用及鉴别检测方法。应用上述方法和常规RT-PCR检测2016-2019年间收集到的664份临床样品,结果表明本研究建立的通用和四重荧光RT-PCR与常规RT-PCR方法的吻合率分别为99.55%和99.40%。同时,应用四重检测方法发现了 2份类NADC30 PRRSV和HP-PRRSV共感染的样品,表明该方法可用于PRRSV共感染情况分析。该方法可在短时间内进行大量样本的鉴别检测,为PRRSV流行病学调查提供了一种更加便捷的鉴别检测方法。研究2.新型高致病性PRRSV毒株XJ17-5和JSTZ712-12的鉴定及致病性分析在应用四重荧光定量RT-PCR检测临床样品过程中,我们发现了两株HP-PRRSV变异株。病原分离后分别命名为XJ17-5和JSTZ1712-12。经过测序分析发现两个分离株全基因组长度均为14,960 bp且同源性达到99.45%。序列分析表明两个分离株Nsp2蛋白上均存在30个氨基酸的不连续缺失和120个氨基酸的连续缺失;经过进化分析表明其属于HP-PRRSV,同时以150个氨基酸不连续缺失为标志与GenBank中另外9个HP-PRRSV毒株形成一个新的进化分支。动物试验结果表明,XJ17-5具有高致病力,可引起仔猪60%的死亡率,而JSTZ1712-12无致病力。此外,全基因组分析发现34个氨基酸差异位点,可能与两个毒株间的致病力差异相关。新型高度同源的HP-PRRSV变异株的鉴定和致病力分析,有利于PRRSV的遗传进化和致病机制研究。研究3.XJ17-5和JSTZ1712-12毒株感染性克隆构建与病毒拯救为了探究XJ17-5与JSTZ1712-12毒株中与其致病性差异相关的氨基酸位点,本研究首先设计、构建并拯救了 XJ17-5和JSTZ1712-12毒株感染性克隆病毒。其次,利用成功建立的rXJ17-5和rJSTZ1712-12感染性克隆平台,进一步构建并拯救了含荧光标记的rXJ-EGFP和rJS-RFP,用于分析两个拯救病毒的体外复制能力;然后,构建并拯救了 120个氨基酸回补株rXJ-120AA和rJS-120AA,可用于探究该缺失特征对毒株复制及其致病力的影响;最后,构建并拯救了 XJ17-5和JSTZ1712-12片段互换的嵌合感染性克隆病毒,可用于解析致病力相关关键区域。XJ17-5和JSTZ1712-12相关感染性克隆病毒的构建与拯救为后期致病力研究提供了有效的技术平台。