论文部分内容阅读
以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)内脏为材料,通过0.01mol·L-1 Tris-HCI缓冲液(pH 7.5含0.2mol·L-1 NaCl,5%乙醇)抽提处理,硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose(DEAE-32)离子交换柱、Sephadex G-100分子筛、第二次DEAE-32离子交换柱3次层析纯化,获得比活力为4490.79U/mg的电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)。该酶亚基分子量分别为121.21、98.63和73.48 kD,等电点为4.5。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,测得该酶在0.2mol·L-1磷酸缓冲液(pH5.6)中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.5,最适温度为45℃;该酶在低于45℃,pH 4.9-9.3范围内稳定。在pH5.6的条件下,酶水解pNP-NAG的米氏常数Km为0.357mmol·L-1,最大反应速度Vmax为10.409umol·L-1·min-1,反应的活化能为76.50KJ/mol。研究几种有机溶剂对该酶活力的影响。结果表明:甲醇和乙醇对酶有先扬后抑作用,正丙醇、异丙醇、甲醛、丙酮、苯酚和二甲亚砜对酶的活性均有不同程度的抑制作用。甲醇、乙醇和异丙醇对酶的抑制类型都为可逆竞争性抑制类型,它们对酶的抑制常数KI分别为3.66mol·L-1、0.36mol·L-1和0.48mmol·L-1。甲醛、苯酚和二甲亚砜对酶的抑制类型属于可逆非竞争性抑制类型,它们对酶的抑制常数KI分别为0.288mol·L-1、0.268mmol·L-1和0.276 mol·L-1。正丙醇、丙酮对酶的抑制类型为可逆混合型抑制类型,正丙醇对酶的抑制常数KI与KIS分别为3.14mmol·L-1和9.35mmol·L-1,丙酮对酶的抑制常数KI与KIS分别为0.195mol·L-1和0.620 mol·L-1。戊二醛对酶活力没有影响。研究金属离子对该酶的影响,结果表明:Na+对酶有激活作用,Ba2+、Ag+对酶活力有先扬后抑作用。Li+和K+对酶有微弱的抑制作用,Mg2+、Cu2+、pb2+、Zn2+、Mn2+和Al3+对酶活力有不同程度的抑制作用。Mg2+、Cu2+和Zn2+对酶的抑制均表现为可逆非竞争性抑制类型,它们对酶的抑制常数KI分别为0.704mol·L-1、1.25mmol·L-1和8.10mmol·L-1。Ag+对酶的抑制作用为可逆反竞争性抑制类型,Ag+对结合酶(ES)的抑制常数KI为204.508mmol·L-1。pb2+对酶的抑制表现为可逆混合型抑制,pb2+对酶的抑制常数KI与KIS分别为10.44mmol·L-1和2.217mol·L-1。Ca2+对酶活力没有显著影响。研究12种氨基酸对该酶的影响。结果表明:在特定浓度范围内,L-Gly、L-Val、L-Thr、L-Ala、L-Phe和L-Ser等氨基酸对酶活力没有显著影响,而L-Gln、L-Met、L-Pro、L-Arg、L-His和L-Lys对河蟹NAGase有不同程度的抑制作用。L-Pro对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型,L-Pro对酶的抑制常数KI为702.87mmol·L-1。L-Arg、L-His和L-Lys对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型,它们对酶的抑制分别为1.682mmol·L-1、85.81mmol·L-1和1.517mmol·L-1。水体中的富营养化产生的SO32-对该酶活力有抑制作用,抑制类型为可逆反竞争性类型,5032-对酶的抑制常数KI为253.995mmol·L-1。NO2-在0-10mmol·L-1范围内对酶活力有激活作用。研究过氧化氢对该酶的影响,结果表明,过氧化氢对酶有抑制作用,抑制类型为可逆反竞争性类型,过氧化氢对结合酶(Es)的抑制常数KI为136.78mmol·L-1。研究尿素对酶的影响,结果表明,尿素对酶活力有抑制作用,尿素对酶的抑制属于可逆混合型抑制类型,尿素对酶的抑制常数KI与KIS分别为379.02mmol·L<sub>-1和1.182mol·L-1。