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实验一AluYb8MUTYH多态性与线粒体D-LOOP区突变谱带关系的分析背景与目的：在多种mtDNA修复机制中,碱基切除修复(BER)是最为普遍的修复方式。MUTYH基因在BER系统中占有主要的作用,与APE1协同作用切除与8-OHdG错配的A,形成AP位点,进行基因的长片段修复(long patch repair),阻止基因组中G:C→T:A的突变。MUTYH基因编码的蛋白存在不同的亚细胞定位,Ⅰ型蛋白产物定位于线粒体内,维持线粒体基因组的稳定；Ⅱ型蛋白产物定位于细胞核内,维持核内基因组的稳定。本研究着重分析导致MUTYH基因Ⅰ型蛋白产物表达受抑的AluYb8MUTYH与mtDNA LOOP区突变谱型的关系。方法：以60例正常人群为研究对象,从外周血中提取DNA,采用PCR-琼脂糖凝胶电泳方法进行AluYb8MUTYH多态性基因分型,电泳分析显示,MUTYH基因intron15呈现出二种不同的片段,长片段为800多bp,含AIuYb8插入序列,短片段为500bp；人群中存在三种基因型,分别为纯合插入型(AluYb8presence/presence, P/P)、纯合野生型(AluYb8absence/absence, A/A)以及杂合型(AluYb8presence/absence, A/P)。同时采用PCR技术扩增线粒体D-LOOP区DNA, T载体克隆PCR产物,并从含目的片段的菌液提取质粒,每例样本选取10个克隆质粒进行测序,比对不同克隆质粒测序结果,分析AluYb8MUTYH不同基因型个体D-LOOP区突变谱带。结果：共发现350个变异位点,大部分变异类型为碱基置换(67%),同时也有短串联重复序列的变异(short tandem repeats,STRs)和碱基缺失／插入,占总变异的29%和4%。P/P基因型平均碱基变异率低于A/A基因型和A/P基因型,但各基因型间比较无统计学差异。结论：MUTYH基因AluYb8插入变异与人mtDNA突变率无显著关系。实验二2型糖尿病患者外周血细胞线粒体拷贝数与AluYb8MUTYH多态性变异的相关性研究背景与目的：2型糖尿病是以高血糖为特征的一种胰岛素抵抗状态,是威胁人类健康的主要疾病之一。糖尿病的发生发展与氧化应激密切相关,高血糖可以引起自由基的产生,导致DNA氧化损伤产物的累积。2型糖尿患者中,8-OHdG是最常见的DNA氧化损伤产物。这种以8-OHdG为标志的DNA氧化损伤主要是通过碱基切除修复机制(base excision repair, BER)来修复。许多研究已确定BER系统基因(hOGG1, MUTYH)变异与2型糖尿病的发病易感性之间的关系。本实验室前期工作发现,人类MUTYH基因第15内含子中存在AluYb8插入变异(AluYb8MUTYH),在中国人群中呈多态性分布。病例-对照研究已显示AluYb8MUTYH P/P基因型是2型糖尿病发病的一个危险因素,本研究进一步探讨AluYb8hMUTYH P/P基因型增加2型糖尿病发病风险可能存在的线粒体机制。研究方法：采集125例2型糖尿病患者和146例健康对照的外周血,提取外周血白细胞DNA,鉴定各样本AluYb8MUTYH基因型。应用荧光实时定量PCR测定入选病例组及对照组个体外周血中mtDNA含量。运用SPSS16.0软件分析糖尿病患者中AluYb8MUTYH不同基因型个体mtDNA含量的差异,同时分析比较携带(AluYb8MUTYH)相同基因型的2型糖尿病患者与健康对照mtDNA含量的变化。结果：携带P/P基因型健康人群外周血mtDNA含量低于携带A/A基因型人群。小于60岁的2型糖尿病组,P/P基因型mtDNA含量显著高于A/P基因型和A/A基因型,这一变化在大于60岁年龄组未发现。与正常对照相比,携带P/P基因型2型糖尿病组外周血mtDNA含量显著高于正常对照组,携带A/P和A/A基因型2型糖尿病患者与正常对照相比,外周血mtDNA含量均无统计学差异。结论：AluYb8MUTYH P/P基因型作为2型糖尿病发病的一个危险因素,可增加2型糖尿病患者外周血mtDNA含量。