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机体在化学氧化剂或自由基等外界环境刺激下,或是正常细胞代谢过程中均能产生活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS),过量的ROS可造成细胞蛋白质,核酸和脂质大分子氧化损伤,破坏细胞氧化和抗氧化平衡状态,导致细胞功能失调。8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)是最常见DNA氧化损伤产物之一,在衰老和肿瘤的发生过程中起着重要作用。8-OHdG常作为氧化损伤的标志物之一。在DNA复制时,8-OHdG易于腺嘌呤(A)错配,造成G：C到T：A的颠换突变。人类mutT同源物1(human mutT homolog1, hMTH1),人类8-羟基鸟嘌呤糖基化酶(human8-oxoguanine glycosylase1, hOGG1)和人类mutY同源物(human mutY homolog, MUTYH)基因构成了8-OHdG修复通路的重要元件。2型糖尿病(Type2Diabetes Mellitus, T2DM)是一个多因素引起的代谢性疾病,典型特征是胰岛素抵抗和／或胰岛素分泌异常。ROS参与胰岛素抵抗,β细胞受损,糖耐量减退并最终导致T2DM及其并发症发生发展的一系列过程。DNA修复基因的多态性变异会改变蛋白功能并降低DNA修复功能,进而引起基因组不稳定,增加年龄相关疾病的发病风险率。探讨DNA修复基因多态性变异和T2DM发病风险的关系可以加深对疾病的遗传学方面的理解,并可能会对糖尿病的预防提供新的途径。本研究中,我们在年龄-性别匹配的T2DM病人和正常对照人群中进行hMTH1, hOGG1和MUTYH基因变异的筛查,探讨这些变异与T2DM发病风险的相关性。同时,在筛查T2DM病人hOGG1基因变异时发现了T2DM病人个别样本DNA疑似嵌合体状态,实验对其进一步的确认并探讨其对基因变异与疾病相关性分析的影响。第一部分：hOGG1基因启动子区嵌合型变异的发现及对多态性变异与疾病风险相关性分析的影响一、研究背景与目的嵌合体是指一个生物体或组织内含有不同遗传信息的细胞系的存在,体细胞嵌合体通常是体细胞产生突变的结果,主要出现在胚胎发育早期。本实验在研究hOGG15’-UTR区C.-53G>C (rs56387615), c.-23A>G (rs1801129)和c.-18G>T (rs1801126)变异与T2DM发病风险相关性时,在突变基因测序分析中发现某些T2DM病人DNA样本突变等位基因峰值较低,本实验探讨其性质及对疾病相关的多态性分析结果的影响。二、方法1.利用高分辨熔解曲线(High Resolution Melting, HRM)方法筛查T2DM病人和正常对照人群DNA样本中hOGG1基因5’-UTR c.-53G>C, c.-23A>G和c.-18G>T多态性变异的基因型。2.直接测序法确定筛查出的杂合型样本的多态性位点基因型。3.PCR产物克隆测序技术分析测序图中有异常突变小峰的DNA样本变异频率并确定其性质。4.焦磷酸测序技术和体外嵌合体模型确定嵌合体的存在。三、结果1. hOGG1基因5’-UTR区c.-53G>C变异的10.71%(3/28)、c.-23A>G变异的13.73%(7/51)和c.-18G>T的2.27%(1/44)呈现嵌合型的变异状态。2.焦磷酸测序技术和体外嵌合体模型支持了以上分析结果。3.病例-对照研究结合统计学分析发现,当嵌合型变异纳入杂合型变异,T2DM病人hOGG1基因5’-UTR区c.-23A>G多态性变异频率显著高于正常对照组,且有统计学意义(OR:2.173;95%CI:1.329-3.554); hOGG1基因5’-UTR区c.-53G>C或c.-18G>T多态性变异频率在病人与对照中无显著性差异；按性别分组时,男性T2DM病人hOGGl基因5’-UTR区c.-23A>G多态性变异频率也显著高于正常对照组,且有统计学意义(OR:2.828;95%CI:1.404-5.697),女性组中无差异性；按年龄分组(<60或>60岁),T2DM病人hOGG1基因5’-UTR区c.-23A>G A/G杂合子频率显著高于正常对照组,且有统计学意义(OR：1.974,95%CI1.071-3.640；OR：2.573,95%CI：1.121-5.908)4.当嵌合型变异不纳入杂合型变异,T2DM病人中hOGG1基因5’-UTR区c.-23A>G多态性变异A/G杂合子频率改变,与正常对照组差异性减小；按年龄分组(<60或>60岁)时,T2DM病人hOGG1基因5’-UTR区c.-23A>G A/G杂合子频率与正常对照组相比无显著性差异。四、结论我们在筛查hOGG1基因5’-UTR区c.-23A>G变异与T2DM发病风险关系时,在个别2型糖尿病患者DNA样本中发现hOGG1基因5’-UTR区嵌合型变异的存在。嵌合型的变异状态可能影响hOGG1基因5’-UTR区c.-23A>G多态性变异的检出,影响疾病关联基因变异分析的结果。第二部分：hMTH1, hOGG1和MUTYH基因多态性变异的联合作用与中国人群2型糖尿病发病风险的研究一、研究背景与目的ROS参与T2DM及其并发症的发生发展过程。hMTH1, hOGG1和MUTYH构成了8-OHdG修复通路的重要元件。本研究中,我们在中国人群T2DM患者和一般对照人群中筛查了hMTH1p.Val83Met (c.247G>A, rs4866)多态性变异,hOGG15’-UTR c.-53G>C, c.-23A>G和c.-18G>T总变异,MUTYH AluYb8插入(AluYb8MUTYH, rs10527342)变异,并且研究了这些变异及其联合作用与中国人群T2DM发病风险的关系。二、方法1.利用HRM方法筛查T2DM病人和正常对照人群DNA样本中hMTH1c.247G>A变异,hOGG1基因5’-UTR区c.-53G>C, c.-23A>G和c.-18G>T多态性变异的基因型。2.直接测序法测定HRM筛查出的hOGG1基因5’-UTR区c.-53G>C, c.-23A>G和c.-18G>T变异的杂合型样本的多态性位点基因型。3.凝胶电泳法对T2DM病人和正常对照人群DNA样本中AluYb8MUTYH变异基因型进行分型。三、结果1. hMTH1c.247G>A变异增加了大于55岁年龄组中国人群的T2DM发病风险(OR=1.579;95%CI:1.029-2.421)。2. hOGGI5’-UTR区c.-53G>C, c.-23A>G和c.-18G>T的总变异与中国人群的T2DM发病风险相关(OR=1.507,95%CI:1.122-2.024)。3. AluYb8MUTYH变异与中国人群的T2DM发病风险相关(OR=1.229,95%CI:1.030-1.466)。4.联合作用分析发现,hMTH1c.247G>A与AluYb8MUTYH在增加T2DM发病风险方面存在协同效应(OR=1.635;95%CI:1.147-2.330);并且hOGG15’-UTR区总变异联合AluYb8MUTYH也可协同提高T2DM的发病风险(OR=1.804;95%CI:1.254-2.595)。四、结论：hMTH1, hOGG1, MUTYH基因多态性变异与中国人群的T2DM发病风险密切相关。本实验结果首次阐述AluYb8MUTYH变异与hMTH1c.247G>A或hOGG15’-UTR区总变异在引起中国人群T2DM发病风险增高中存在协同关系。