论文部分内容阅读
恶性肿瘤已经成为严重危害人类健康的头号疾病,死亡率极高。恶性肿瘤常用的三种治疗手段即手术、化疗和放疗。但是,手术治疗存在高风险、创伤大及易产生并发症等缺点;化疗和放疗在杀死癌细胞的同时,会给人体的正常细胞带来严重的损伤,大大降低了患者的生存质量。同时单一的治疗方法存在两大缺陷,一是前期不能对疾病的检测或者诊断;二是治疗后对病灶部位的治疗效果不能实时检测。因此,发展诊断和治疗一体化是必然趋势。近年来,纳米技术的发展为诊断治疗一体化这个目标的实现提供了新的思路。纳米诊断治疗体系是将抗恶性肿瘤药物和成像试剂集成在纳米粒子中。磁共振成像(MRI)在恶性肿瘤的诊断和实时检测上有一定的优势,MRI是一种对软组织弥散加权成像的有力工具。但是已被报道的纳米诊断治疗体系存在一系列的问题如:MRI分辨率低、靶向性不足以及药物载体不能在靶细胞中有效快速地释放药物。基因治疗也存在以上这些问题。因此,以超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)为核心的MRI造影剂经亲水性高分子修饰后,其水溶性和生物相容性得到增强、毒性小以及在生物体内半衰期长。同时,SPIONs对外加磁场具有高敏感性,能缩短横向驰豫时间(T2)。因此SPIONs是一类高效的造影剂。叶酸在很多肿瘤细胞膜上都有受体可作为主动靶向。载体内含有还原响应型的二硫键在还原剂如谷胱甘肽(GSH)或二硫苏糖醇(DTT)条件下二硫键断裂被还原成巯基,因此在目标细胞内能有效快速的释放药物。综上,具有还原响应型的靶向SPIONs药物载体能够实现诊断治疗一体化的目标。另一方面,聚乙烯亚胺(PEI)作为压缩基因的非病毒载体与SPIONs键接能够成为基因载体进行诊断和基因治疗。带有正电荷的PEI通过静电作用压缩带负电的DNA在支化的PEI分子结构内,且能保护DNA在生物体内循环时不被降解即保护其活性。同时PEI与交联剂(含有二硫键)相连在GSH或DTT存在的条件下,二硫键断裂被还原释放DNA。所以具有还原响应型磁性纳米基因载体可以为基因诊断与治疗的一体化提供新的思路。在本论文中,对还原响应型的磁性载体从药物载体和基因载体两方面来研究,并对细胞水平的治疗和成像做出了初步研究,具体内容包括:1.MNPs-DOX药物传递在本论文中,利用多功能高分子聚合物与SPIONs通过交换配体反应组装成磁性诊疗一体化纳米粒子。其具有血液循环稳定性、靶向性、可控药物释放以及MRI成像等功能。在制备过程中以N,N-双(丙烯酰)胱胺(BACy)作为交联剂,阿霉素(DOX),多巴胺(DA),叶酸-聚乙二醇胺(FA-PEG-NH2)和甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)作为共聚单体,通过迈克尔加成反应合成了多功能共聚物聚酰胺胺(PAMAM)。然后,PAMAM通过与SPIONs的配体交换直接组装到SPIONs的表面,形成载有抗癌药物的还原响应型的靶向磁性纳米颗粒(MNPs-DOX)。作为亲水部分的PEG能够提高纳米粒子在水溶液的稳定性和分散性,交联结构能够提高纳米粒子在循环时的稳定性。在MNPs-DOX的体外药物释实验中,结果表明,在含有谷胱甘肽(GSH)的环境中,药物载体在48小时内累积释放药物高达60%。在没有GSH的环境下即在PBS(pH 7.4)中,药物载体的累积释放量只有20%。MNPs-DOX具有857μgDOX/mg铁的高载药效率,并且MNPs-DOX的横向驰豫值R2高达126 mM-1·S-1,可用于MRI成像,优于临床应用的产品。细胞实验结果表明,MNPs对HUVEC细胞(正常细胞)具有低毒性,并且MNPs-DOX对HeLa细胞(肿瘤细胞)有高效的治疗作用。HeLa细胞的共聚焦实验展现出MNPs-DOX能顺利入胞。以上实验结果表明,制备的MNPs-DOX有希望成为一种可临床使用的、高效的诊疗一体化的药物载体。2.rPEI-DMA@SPIONs基因传递在本论文中,阳离子聚合物与超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)通过交换配体形成基因载体,同时可作为MRI的造影剂,实现基因诊疗一体化的目标。通过迈克尔加成反应合成了多功能共聚物rPEI-DMA,以中N,N-双(丙烯酰)胱胺作为交联剂,支化低分子量的(MW=600)聚乙烯亚胺(PEI)和多巴胺甲基丙烯酰胺(DMA)作为共聚单体,通过迈克尔加成反应合成了多功能共聚物rPEI-DMA。rPEI-DMA与SPIONs通过配体交换形成具有还原响应型的聚阳离子磁性纳米粒子rPEI-DMA@SPIONs,其具有9.77 mg DNA/mg铁的高载基因效率。同时rPEI-DMA@SPIONs的R2驰豫值为81 mM-1·S-1可成为MRI造影剂。动态光散射实验结果表明在含GSH的环境下rPEI-DMA@SPIONs能快速降解释放DNA。凝胶电泳实验和溴乙锭荧光实验结果表明,当rPEI-DMA@SPIONs与DNA的质比(rPEI-DMA@SPIONs/DNA)为1时DNA全部被压缩,展现了rPEI-DMA@SPIONs优秀的DNA携带能力;同时rPEI-DMA@SPIONs与DNA随着质比的变化电位随之变化,质比为1时电荷翻转由负电变为正电有利于细胞内吞。细胞实验结果表明,rPEI-DMA@SPIONs对具有低毒性且很强的基因转染效果。综上,rPEI-DMA@SPIONs有望成为优秀的基因载体。