论文部分内容阅读
食线虫真菌是一类土壤微生物,作为线虫的天敌,它们对于维持线虫在土壤.生态外境中的种群动态平衡发挥着十分重要的作用。寡孢节丛孢(Arthrobotrys oilgospora)是研究捕食线虫真菌与线虫相互作用的模式菌株,它能产生三维菌网捕捉线虫。2011年,本课题组报道了寡孢节丛孢的基因组序列,为进一步研究捕食器官形成的分子机制奠定了基础。本论文以△AAoStA突变株为研究对象,比较了寡孢节丛孢原始菌株和△AoStuA突变株表型特征的差异。同时,通过转录组测序比较△AoStuA突变株和原始菌株经线虫提取液诱导不同时间点的基因表达水平变化,对显著差异表达基因进行了 GO基因功能富集分析和KEGG pathway分析。主要实验结果如下:1、寡孢节丛孢野生株和AoStuA基因突变株的表型特征比较△AoStuA突变株在PDA等培养基上的生长速率显著低于原始菌株,产孢率显著降低,且大部分孢子形态畸形,呈现不完全发育,孢子的萌发率也低于原始菌株,萌发后的菌丝分化程度明显弱于原始菌株,并且不能产生三维菌网,捕杀线虫的能力丧失,对NaCl、H202和SDS的抗性减弱,胞外蛋白酶水解活性下降。2、寡孢节丛孢原始菌株和△AoStuA突变株中差异表型相关基因Real Time PCR分析收集在相同条件下培养的寡孢节丛孢原始菌株和△AoStuA突变株经线虫提取液诱导不同时间点收集的样品进行总RNA的提取,逆转录获得cDNA,选取部分G蛋白信号调控途径相关基因、过氧化物酶体合成相关基因、产孢调控相关基因、蛋白酶相关基因及抗逆性相关基因进行Rea1 Time PCR(RT-PCR)分析,结果显示,AoStuA基因突变后,大部分的产孢等表型相关基因的转录水平都发生了下调,AoStuA上游基因中Ras2(AOL_s00215g7)显著下调、下游基因中Msn2,4 蛋白家族 AOL_s00004g650 基因、MCM 蛋白家族 AOL_s00080g270 基因、ORC家族AOL_s00076g653基因显著下调;过氧化物酶体合成相关基因Pex1(AOL_s00054g771)、Pex3(AOL_s00215g610)、Pex11(AOL_s00083g431)和Pex14(AOL_s00004g492)、PMP34 蛋白家族中 AOL_s00083g158 和AOL_s00215g205 基因、MPV17 蛋白家族中 AOL_s0054g405 和 AOL_s00006g18基因下调显著。3、寡孢节丛孢原始菌株和△AoStuA突变株的转录组测序分析提取了寡孢节丛孢原始菌株和△AoStuA突变株经线虫提取液诱导后0 h、12 h、36 h、48 h的菌丝总RNA,对其进行转录组测序,获得八组转录组数据。通过数据分析发现AoStuA基因突变后有部分基因发生差异表达,从这些差异表达的基因中发现一些可能与捕食器官形成有关的基因,如MAPK通路基因AOL__s00076g411、AOL__s00083g305、AOL__s00076g496、AOL__s00054g653 和AOL__s00007g300;过氧化物酶体通路基因AOL_s00054g476和AOL__s00173g103;谷胱甘肽代谢通路基因AOL_s00043g230;二羧酸盐代谢通路基因 AOL_s00006g210 和 AOL__s00006g411;另外,AOL_s00188g243 基因是一种过氧化氢酶,它同时参与过氧化物酶体通路等多条途径。通过参考物种的比对,预测部分基因可能的功能,为深入研究寡孢节丛孢捕食器官形成的分子机制奠定了基础。本文的主要创新点:1、对寡孢节丛孢原始菌株和AAoStuA突变株部分表型特征进行了较为系统的比较,初步推测AoStuA基因在寡孢节丛孢生长发育过程中的功能。2、用RT-PCR技术比较了部分基因在寡孢节丛孢原始菌株和△AoStuA突变株中不同时间点的转录水平变化,说明AoStuA基因调控寡孢节丛孢过氧化物酶体生物合成基因的表达,影响其上下游基因的表达;此外,△AoStuA突变株中细胞壁合成、过氧化氢酶合成、孢子形成和蛋白酶合成等表型相关基因的转录水平下调,导致了突变株表型的变化。3、利用RNA-seq技术,比较寡孢节丛孢原始菌株和AAoStuA突变株在产生捕器不同时间点的转录水平变化,筛选得到若干可能和捕食器官产生调控相关的基因,为进一步阐释寡孢节丛孢产生捕食器官的分子机制奠定基础。