随着世界人口的老龄化,与其有密切关联的神经退行性疾病:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease AD）的发病率也不断的攀升。由于对AD的病因及发病机制的认识尚不清楚,在治疗方面存在极大的困难,目前还没有根治的方法,所以如何治疗与预防AD已成为了一个为世界所关注的问题。AD临床表现为进行性的记忆衰退和认知功能的下降,行为异常和社交障碍,通常病情呈进行性加重。它的主要病理特征表现为脑神经细胞外β-淀粉样蛋白（beta-amyloid protein,Aβ）沉积形成老年斑,脑神经细胞内tau样蛋白异常聚集形成神经纤维缠结。近年来对AD的病因学研究取得了很大的进展,一般认为可能与胆碱能神经的丢失所致的功能进行性下降及遗传和环境因素所引起的脑内慢性炎症有密切的关联,但具体环节不清楚还有待研究。但AD与Aβ的关系一直是研究的热点,认为Aβ沉积引起的继发性慢性炎性反应与AD的发生、发展有很大关系,也是导致胆碱能神经元退行性变的重要原因。小胶质细胞是中枢神经系统中主要参与炎性反应的细胞。有文献报道它激活后可释放多种细胞因子、趋化因子、补体及其激活物,导致非特异性炎性细胞浸润,产生慢性炎症,使神经系统受损。虽然拟胆碱药物、乙酰胆碱酯酶抑制剂、抗氧化、以及抗炎药物都具有一定疗效,但迄今为止,仍没有治疗AD的特效药物。在目前的治疗方法中通过增加颅内胆碱能水平和N型乙酰胆碱受体激动剂对改善AD症状有一定疗效,但对其作用机制的认识尚不清楚。现有研究显示外周迷走神经受刺激后释放的胆碱能神经递质与巨噬细胞α₇-nAChR受体作用,可以抑制巨噬细胞炎性介质的合成与分泌,削弱外周炎性反应。在中枢神经系统虽然没有外周巨噬细胞,但有与外周巨噬细胞相似功能的小胶质细胞参与中枢炎性反应,那么,小胶质细胞是否也具有α₇-nAChR以及激活小胶质细胞α₇-nAChR能否削弱Aβ介导的中枢炎性反应便值得关注。小胶质细胞α₇-nAChR激活如何参与削弱Aβ介导的炎性反应虽无报导,但有关炎性反应调控的研究显示,MAPK信号通路是调控炎性介质合成与分泌的主要途径。大量证据表明MAPK在介导和调节炎症反应中起着重要的作用,在哺乳动物细胞已鉴定出细胞外信号调节激酶（extracellular-signalregulated protein kinase,ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminalkinase,JNK）/应激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK）、p38和大丝裂原活化蛋白激酶（big MAP kinase 1,BMK1）/ERK5四条MAPK通路。因此,我们推测小胶质细胞α₇-nAChR激活对炎性介质的调控可能通过抑制MAPK通路,从而降低Aβ沉积所引起的炎性介质的合成与分泌以减轻炎性反应,这一假设亟待研究。本研究采用原代细胞培养技术,进行小胶质细胞的培养,通过分子生物学和免疫学技术,首先分别从基因与蛋白水平明确是否有α₇-nAChR在小胶质细胞的表达,然后观察Aβ作用于小胶质细胞4h,8h,24h,48h,72h,96h后炎性介质IL-6、TNF-α、MIP-1、MCP-1α、RANTES的分泌变化,用烟碱预激活小胶质细胞α₇-nAChR看是否能削弱Aβ引起的炎性介质的合成与分泌。为探讨MAPK通路中P38及ERK两条通路在其中的作用,用P38及ERK特异性抑制剂SB203580与PD98059进行研究,最后探讨小胶质细胞α₇-nAChR的激活是否能减少对神经元的毒性作用。方法1.小胶质细胞培养取新生SD大鼠,消毒后,采用无菌方法迅速取出大脑,分离海马,经胰蛋白酶消化后离心,弃上清再制成细胞悬液,接种至细胞培养瓶中培养。待混合培养细胞生长至7-9天,用利多卡因分离纯化小胶质细胞,并通过小胶质细胞特异性抗体CD11b/c进行检测,用Hoechst33258核染以鉴定小胶质细胞的纯度。2.从mRNA及蛋白水平鉴定α₇-nAChR在小胶质细胞上的表达取分离纯化好的小胶质细胞,用TRIZOL提取总RNA。用RT-PCR方法进行目的基因的扩增,以:For 5’CAT TGA CGT TCG CTG GTT CC-3’Rev 5’ATGGTG CTG GCG AAG TAT TG-3’为扩增引物。PCR产物跑1.2%琼脂糖凝胶电泳,100V电泳45min,置紫外灯下观察,用凝胶成像仪扫描图像。取PCR产物进行DNA测序。以CD11b/c单克隆抗体及抗α₇-nAChR抗体为一抗,用荧光双染技术,从功能蛋白水平分析α₇-nAChR在小胶质细胞上的表达。3.小胶质细胞α₇-nAChR激活对炎性介质分泌的影响分离纯化并培养小胶质细胞,并分别收集激活与未激活α₇-nAChR的小胶质细胞培养上清液,采用液相芯片技术,用Luminex机器检测上清中白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、巨噬细胞炎性蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-1、RANTES的变化,明确小胶质细胞α₇-nAChR在削弱Aβ所致炎性反应中的作用。4.MAPK通路在小胶质细胞α₇-nAChR激活削弱炎性介质分泌的作用对MAPK通路中的P38、ERK两条信号转导通路进行研究,分别利用这两种通路的特异性抑制剂,然后收集抑制与未抑制这两条通路的细胞培养上清液进行炎性介质的测定,通过分析明确哪些炎性介质与MAPK通路有关,与哪条MAPK通路有关。5.α₇-nAChR激活对神经元的保护作用DAB免疫组织化学方法及免疫荧光方法对原代培养的神经元进行鉴定,并核染进行纯度的测定。根据实验目的分为空白对照组、Aβ蛋白组、共培养组、烟碱预处理组。用Transwell进行神经元与小胶质细胞共培养,通过流式细胞仪及Fluorescein FragEL^TM DNA Fragmentation Detection Kit凋亡试剂盒检测神经元的凋亡数。结果1.小胶质细胞培养与鉴定:原代混合培养细胞主要是以星形胶质细胞为主,并含有小胶质细胞、神经元细胞和少量的少突胶质细胞。传代培养后,神经元消失。通过利多卡因液分离获得纯化的小胶质细胞,在显微镜下观察:在正常情况下小胶质细胞处于静息状态,胞体小,突起细长,分枝状。以特异性单克隆抗体CD11b/c为探针进行荧光细胞免疫鉴定,呈阳性。2.α₇-nAChR在小胶质细胞的表达:从纯化了的小胶质细胞中提取总RNA,并利用RT-PCR的方法能扩增出450bp的目的条带,对PCR产物进行DNA测序,并与genebank中的α₇-nAChR目的基因进行比对,基因序列一样。细胞免疫荧光双标分析显示小胶质细胞抗-CD11b/c和抗-α₇-nAChR染色均呈阳性。3.Aβ与小胶质细胞炎性因子的分泌:在培养的小胶质细胞中加入10μmol/LAβ后,分别在Aβ作用后的4h、8h、24h、48h、72h、96h收集细胞上清液,用液相芯片技术检测IL-6、TNF-α和MIP-1、MCP-1、RANTES含量变化,其中Aβ对IL-6、MIP-1α、MCP-1、和RANTES含量变化影响明显,与空白组比较,差异显著（p＜0.05）,表现在Aβ作用后,随时间的增加炎性因子及趋化因子的量也增加。4.小胶质细胞α₇-nAChR激活对Aβ介导炎性因子分泌的影响:在Aβ作用前,用10μmol/L的nicotine预激活胶质细胞α₇-nAChR,观察Aβ与小胶质细胞作用96h后炎性介质的变化情况,结果显示:用烟碱预激活胶质细胞α₇-nAChR可以明显削弱Aβ介导的小胶质细胞炎性介质及趋化因子IL-6、MIP-1α、MCP-1、和RANTES的分泌,同α₇-nAChR未激活前比较,差别有统计学意义（P＜0.05）。5.MAPK通路在小胶质细胞α₇-nAChR激活削弱炎性介质分泌的作用的研究结果:P38、ERK通路被抑制之后结果显示:SB能使Aβ介导的小胶质细胞分泌IL-6、MIP-1、MCP-1α、RANTES明显减少,若在SB阻断P38通路基础上,再经过nicotine与小胶质细胞作用,该4项指标可进一步降低,尤其是趋化因子,其中MCP-1由1777.41±116.3降至642.64±82.57,继续降低了2倍。用PD阻断ERK通路的结果与SD效果类似,但nicotine预作用不能进一步使PD的作用增强。6.α₇-nAChR激活对神经元的保护作用:原代培养的神经元,利用神经元特异性抗体NSE进行免疫组织化学染色,可见神经元胞浆及突起被染成棕褐色;用MAP-2单克隆抗休进行免疫荧光检测,并用Hoechst33258进行核染,神经元的纯度达到了94.49%±1.22%。用TUNNEL标记的方法检测神经元的凋亡,凋亡率分别为13.28%±2.93%,18.65%±2.06%,30.40%±1.14%,20.60%±1.34%。流式细胞仪检测Aβ蛋白作用于各组神经元96h之后神经元出现的凋亡率,分别为16.60%±1.63%,30.90%±4.27%,47.86%±6.70%,28.73%±2.80%。两种方法显示Aβ蛋白对共培养组的神经元的凋亡率与Aβ组比较差异具有显著性,（P＜0.05）,烟碱预处理组的凋亡率与共培养组的凋亡率比较明显的减低,差异具有显著性（P＜0.05）。结论1.α₇-nAChR在体外培养的小胶质细胞上均能正常表达。2.Aβ作用于小胶质细胞后炎性细胞因子及趋化因子IL-6、MCP-1、MIP-1、RANTES的分泌量随时间的增加而增加。小胶质细胞α₇-nAChR的激活可削弱Aβ引起的IL-6、MCP-1、MIP-1、RANTES的分泌。3.MAPK通路中的P38、ERK两条通路参与了Aβ蛋白介导的小胶质细胞炎性细胞因子分泌及α₇-nAChR的激活削弱Aβ引起的炎性因子的分泌。4.Aβ蛋白通过小胶质细胞释放的炎性介质及趋化因子对神经元产生毒性作用,小胶质细胞α₇-nAChR激活对神经元的具有保护作用。