阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是以认知功能进行性下降和情感障碍为特点的神经退行性疾病。近年来,AD的发病率及发病人数呈逐年上升的趋势,预计到2050年,全球AD患者将达到1.154亿。到目前止,还没有一种药物或方法能够有效治疗和控制AD,如何预防和治疗AD已成为刻不容缓的研究课题。有关AD的发病机制存在多种假说,其中炎性假说已经引起广泛的关注。AD患者颅内炎症反应是Aβ (β amyloid,Aβ)介导的继发性反应,是导致神经退行性病变的重要因素。参与炎性反应的细胞主要有星形胶质细胞和小胶质细胞,这些细胞被激活后可持续释放多种细胞因子、趋化因子、补体及其激活物,导致非特异性炎性细胞浸润。小胶质细胞和星形胶质细胞分泌的如IL-1、IL-6、 TNF-α、MCP-1α等炎性因子可经多种机制造成中枢神经损伤,诱导神经元凋亡。神经元丢失后,成年人SVZ (Subventricular zone, SVZ)等部位存在的神经干细胞(neural stem cell, NSC)在适当条件下可以分化形成新的功能性神经元、胶质细胞。而在AD中,由于炎性介质及各种神经毒性物质的影响,神经元,特别是胆碱能神经元数目持续不断减少,得不到及时补充,其原因可能就是AD患者颅内炎性“微环境”影响神经干细胞功能发挥,抑制神经干细胞的增殖和分化。因此,中枢炎性反应对神经干细胞的确切影响以及如何改善炎性反应成为AD研究亟待解决的问题。研究报道,巨噬细胞α7-nAChR (α7nicotinic acetylcholine receptor, α7-nAChR)激活后可以减弱炎症反应。nAChRs是一种由五聚体构成的300kD的桶状结构的离子通道,广泛存在于神经系统。本课题组前期研究已经证实星形胶质细胞和小胶质细胞都存在α7-nAChR的表达,其主要功能是实现胆碱能神经递质的信号传递。巨噬细胞α7-nAChR激活后降低了炎性介质的表达和释放,小胶质细胞和星形胶质细胞与巨噬细胞在炎性反应中功能相似,胶质细胞α7-nAChR激活后炎性介质的分泌可能也会减少。在本研究中,我们用transwell板建立胶质细胞与神经干细胞的体外共培养体系,神经干细胞和胶质细胞分别培养在transwell板的上层和下层,通过在下层的胶质细胞中加入Aβ模拟AD炎性微环境,并经液相芯片技术检测细胞因子和趋化因子的表达,流式细胞术检测神经干细胞的凋亡,探讨Ap刺激胶质细胞产生的炎症反应对神经干细胞的影响。通过加入尼古丁激活胶质细胞α7-nAChR,研究胶质细胞α7-nAChR激活后对炎性反应的抑制及对神经干细胞的保护作用。在体外研究的基础上,我们通过立体定位技术注射Ap到大鼠海马中,Ap刺激胶质细胞分泌炎性因子,借此构建AD炎性模型,并通过皮下注射尼古丁方式激活胶质细胞α7-nAChR。BrdU (Bromodeoxyuridine, BrdU)标记后的外源性神经干细胞经立体定位技术注入海马内,经免疫荧光双染技术检测外源性神经干细胞在体内的增殖和分化情况,明确胶质细胞a7-nAChR激活后对神经干细胞增殖分化的影响。方法1.海马NSCs培养及鉴定出生24h SD大鼠置于75%酒精中浸泡消毒30s。无菌条件下断头取全脑置于冰PBS中,分离出海马组织,移液枪轻轻吹打开海马组织。胰蛋白酶消化,置细胞培养箱中消化20min。然后加入等体积含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化,过滤。收集滤液离心,弃上清,细胞沉淀用含EGF、bFGF、B27和青链霉双抗的DMEM/F12培养液重悬,台盼蓝染色计数,调整细胞密度至1×106/ml,接种,置培养箱中培养,每隔3-4d半量换液。通过神经干细胞特异性抗体Nestin进行免疫细胞化学检测,同时以DAPI对细胞核进行复染,计算神经干细胞纯度。2.小胶质细胞培养取出生24h内的SD大鼠,取脑,分离海马,胰蛋白酶消化,制成的单细胞悬液以5×105/ml细胞密度接种于预先经多聚赖氨酸包被处理的培养瓶中,孵育箱中培养2d后全量换液,待培养至9-10d,手摇法分离纯化小胶质细胞。通过小胶质细胞特异性抗体CD11b/c进行免疫细胞化学检测,同时以DAPI对细胞核进行复染,计算小胶质细胞纯度。3.星形胶质细胞培养参照McCarthy等方法进行大鼠海马星形胶质细胞培养。取出生24h内的SD大鼠,75%乙醇浸泡消毒后,迅速取出大脑,剔出脑膜和血管；分离海马,经0.125%胰蛋白酶消化、1000rpm离心、弃上清后制成细胞悬液,接种至细胞培养瓶中,于37℃、5%CO2培养。待混合培养细胞生长至8-10天,于37℃摇床中以250rpm/min振荡4h,除去悬浮细胞,收集贴壁细胞继续培养。4. Transwell共培养体系的建立及体外研究分组利用共培养小室建立神经干细胞与星形胶质细胞和小胶质细胞的体外共培养模型,三种细胞按1：1：1加入。具体分组如下：A.空白对照组(control):神经干细胞培养于上室,星形胶质细胞和小胶质细胞培养于下室；B.星形胶质细胞组(Astrocyte+NSCs+Aβ1-2):神经干细胞培养于上室,星形胶质细胞培养于下室,在星形胶质细胞培养液中加入终浓度为10μM/L的Ap1-42；C.小胶质细胞组(Microglia+NSCs+Aβ1-42):神经干细胞培养于上室,小胶质细胞培养于下室,在小胶质细胞培养液中加入终浓度为10μM/L的Aβ1-42；D.共培养对照组(NSCs+Microglia+Astroycte+Aβ1-42):神经干细胞与小胶质细胞和星形胶质细胞以1：1：1的浓度比接种于上室与下室,并在小胶质细胞和星形胶质细胞的下室中加入终浓度为10μM/L的Aβ1-42；E.α7-nAChR阻断组(NSCs+Microglia+Astrocyte+Aβ1-42+nicotine+bungarotoxin):细胞培养方法同共培养对照组,先在小胶质细胞和星形胶质细胞中加入a7-nAChR阻断剂银环蛇毒素,4h之后再加入终浓度为10μM/L的尼古丁,尼古丁加入1h后加入终浓度为10μM/L的Aβ1-42;F.α7-nAChR激活组(NSCs+Microglia+Astrocyte+Aβ1-42+nicotine):细胞培养方法同共培养对照组,先在小胶质细胞和星形胶质细胞中加入终浓度为10μM/L的尼古丁,1h后再加入终浓度为10gM/L的Aβ1--42；5.液相芯片技术检测炎性因子共培养体系中炎性介质的检测采用液相芯片技术,各处理组于48h后收集细胞上清液,检测IL-6、MIP-1α和RANTES,所有操作根据大鼠炎性因子检测试剂盒进行。6.流式细胞仪检测神经干细胞凋亡率神经干细胞球制备成单细胞液悬浮培养,按照各实验分组情况进行相应处理。48h后,参照Annexin V-FITC/PI检测试剂盒说明书进行前期处理,上流式细胞仪检测。7.立体定位技术造模及注射神经干细胞采用立体定位仪将Aβ1-42注入大鼠海马中,制作AD炎症模型。同时按照各实验分组对大鼠进行相应处理。体内研究分组为：A.神经干细胞组(NSCs):大鼠注射NSCs,其它操作平行进行。B.Ap模型组(Aβ1-42)：大鼠注射Aβ1-42,其它操作平行进行。C.神经干细胞+Ap模型组(NSCs+Aβ1-42):大鼠先注射Aβ1-42制作老年痴呆炎性模型,之后注射神经干细胞。D.尼古丁+神经干细胞+Aβ模型组(nicotine+NSCs+Aβ1-42):大鼠注射Aβ1-42制作老年痴呆炎性模型,并皮下注射尼古丁预激活胶质细胞a7-nAChR,最后注射神经干细胞。8.免疫荧光双染检测BrdU标记神经干细胞的增殖分化取大鼠脑组织冰冻切片,脑片经多聚甲醛固定后用蒸馏水漂洗,2N HCl37℃变性处理30分钟,蒸馏水漂洗。封闭液室温封闭2小时后不洗,直接加入BrdU一抗,置4℃过夜,之后再在37℃孵育30分钟。0.1M PBS漂洗。在经TRITC标记的抗大鼠二抗室温孵育60分钟。O.1M PBS漂洗。在Nestin、MAP-2、OX42、 GFAP、CHAT一抗中孵育,置4℃过夜,37℃孵育30分钟。0.1M PBS漂洗。在经FITC标记的抗小鼠二抗中室温孵育60分钟。0.1M PBS漂洗。封片,观察。9.大鼠脑炎性因子检测大鼠海马组织取出后称量,用生理盐水于冰上用匀浆器对海马进行匀浆,4℃,12000r/min离心,收集上清,-70℃冰箱保存待测,IL-6、MCP-1α、MIP-1α和TNF-α的检测按ELISA试剂盒说明进行。10.动物行为学检测Y迷宫由三个相同的臂组成,三臂间夹角各为120度。各臂顶端都有一个信号灯,灯亮则表示此臂无电击,是安全区,其余为电击区,安全区的方位随机变换。在测试的时候,用黑布盖住Y迷宫各臂,以免其它光源影响实验。测试开始后,先让大鼠在Y迷宫内适应10分钟,然后以其所处的臂为起步区,给予70V电击刺激,大鼠在足底通电后10秒内一次性跑向安全区为正确反应,否则为错误反应,向所在的起步区逆向跑也视为错误反应。大鼠逃到安全区后,灯光继续作用15s,之后熄灯休息15s再进行下一次操作。随机转换安全区,以连续10次测试中9次都正确反应所需要的电击次数表示大鼠的学习能力,若次数超过100次,则不再记录。记忆能力在学习完24h后再检测,以连续10次测试中9次都正确反应所需要的电击次数表示。11.统计学处理所有统计分析均用SPSS16.0统计软件分析。数据均采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch法。组间两两比较时,若方差齐性,则采用最小显著性差异法(LSD法)；若方差不齐,则采用Dunnett’T3方法。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1.神经干细胞,小胶质细胞和星形胶质细胞的培养与鉴定用神经干细胞的特异性标志物Nestin对体外培养的NSCs进行鉴定,鉴定为Nestin染色阳性细胞与DAPI核染比值即为神经干细胞纯度,结果显示神经干细胞球呈Nestin阳性,纯度大于95%。用小胶质细胞的特异性标志物OX42对体外培养的小胶质细胞进行鉴定,OX42染色阳性细胞与DAPI核染数目比值即为小胶质细胞纯度,显微镜下观察,小胶质细胞胞体扁平或卵圆形,突起细长。免疫荧光染色呈OX42阳性,纯度大于95%。用星形胶质细胞的特异性标志物GFAP对体外培养的星形胶质细胞进行鉴定,GFAP染色阳性细胞与DAPI核染数目比值为星形胶质细胞纯度,显微镜下观察,星形胶质细胞胞体粗大,胞突丰富,多分支。免疫荧光染色呈GFAP阳性,纯度大于95%。2.胶质细胞α7-nAChR激活对炎性因子分泌的影响。各组细胞处理48h后,收集上清液进行炎性因子的检测。在Ap的刺激下,小胶质细胞,星形胶质细胞均能释放IL-6、MIP-1α和RANTES。星形胶质细胞组中IL-6、MIP-1α和RANTES的浓度为空白对照组的7.0、10.4和4.2倍,小胶质细胞组中IL-6、MIP-1α和RANTES的浓度为空白对照组的7.5、3.8和2.9倍。小胶质细胞与星形胶质细胞的共培养组在Aβ的刺激下,IL-6、MIP-1α和RANTES的释放量增至空白对照组的12.8、12.4、9.5倍。因此,小胶质细胞和星形胶质细胞在Ap的刺激下分泌的炎性因子显著高于Ap单独刺激小胶质细胞或星形胶质细胞的情况。而用尼古丁预处理小胶质细胞和星形胶质细胞后,IL-6、 MIP-1α和RANTES的分泌量显著降低,分别为3.7、4.5、2.7倍。当胶质细胞α7-nAChR被银环蛇毒素阻断后,尼古丁抗炎作用减弱,IL-6,MIP-1α和RANTES浓度为10.6、11.5和9.7倍。因此,胶质细胞α7-nAChR激活后,炎性因子分泌减少。3.胶质细胞α7-nAChR激活对神经干细胞的影响。流式检测结果显示,在小胶质细胞组中,Ap介导的炎症反应而引起的神经干细胞凋亡率为20.32%；在星形胶质细胞组,神经干细胞的凋亡率为21.06%。而在小胶质细胞与星形胶质细胞共培养体系中,神经干细胞的凋亡率显著升高,为33.34%,显著高于小胶质细胞组、星形胶质细胞组。在Ap加入前1h,用尼古丁预激活胶质细胞α7-nAChR,结果显示神经干细胞凋亡率显著下降,为13.91%,比未激活组降低近20%,差异具有统计学意义(p<0.05)。而当用银环蛇毒素阻断胶质细胞α7-nAChR后,在Ap的刺激下,神经干细胞的凋亡率为25.46%,与尼古丁组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。因此,胶质细胞α7-nAChR激活后降低神经干细胞凋亡率,产生神经保护作用。4.胶质细胞α7-nAChR激活对AD炎性模型脑内炎性因子分泌的影响大鼠海马ELISA炎性因子检测结果显示,在正常大鼠注射神经干细胞后,海马内IL-6、MIP-1α、MCP-1α、TNF-α水平为31.4±7.0、67.6±12.1、132.8±9.9.64.8±6.8pg/mg。而在Ap炎性模型组中,IL-6、MIP-1α、MCP-1α和TNF-α浓度为57.8±9.5、175.4±8.2、307.7±11.6、214.0±12.2pg/mg,相对于正常大鼠组,各炎性因子水平显著升高。在神经干细胞植入的Aβ炎性模型组中,IL-6、MIP-1α、MCP-1α浓度高于Ap炎性模型组。而在尼古丁激活α7-nAChR后,IL-6、MIP-1α、MCP-1α和TNF-α浓度分别为37.2±3.4、92.7±6.8、193.1±12.8和101.8±8.5pg/mg,相对于神经干细胞炎性模型组,各炎性因子浓度降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。5.胶质细胞α7-nAChR激活对体内神经干细胞增殖分化的影响胶质细胞α7-nAChR激活增加神经干细胞增殖率,增加神经干细胞分化成神经元,胆碱能神经元,星形胶质细胞的比例。而分化成小胶质细胞的比例与未激活组相比无统计学差异(p>0.05)。6.胶质细胞α7-nAChR激活改善动物学习记忆功能。Y迷宫测试大鼠学习记忆能力,结果显示,尼古丁组大鼠学习记忆功能高于Ap模型组和神经干细胞Aβ模型组,差异具有统计学意义(p<0.05)。Ap模型组和神经干细胞Ap模型组相比,大鼠学习记忆功能无明显改变,差异无统计学意义(p>0.05)。结论1.建立神经干细胞与小胶质细胞和星形胶质细胞体外共培养模型。2.Ap1-42刺激胶质细胞释放炎性因子产生炎症反应,诱导体外培养神经干细胞凋亡。3.胶质细胞α7-nAChR激活减少炎性因子的分泌,抑制Aβ1-42介导的炎症反应。4.胶质细胞α7-nAChR激活可削弱Aβ142介导的炎症反应对神经干细胞增殖分化的抑制和促凋亡作用,补充中枢神经细胞。5.胶质细胞α7-nAChR激活后,神经干细胞植入治疗可改善大鼠学习记忆能力。