阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人中常见的一种中枢神经系统(central nervous system, CNS)退行性疾病。目前传统治疗药物包括抗β-淀粉样蛋白药物、胆碱酯酶抑制剂(CHEI)、抗炎药物、自由基清除剂和抗氧剂、钾通道阻滞剂及脑代谢改善药等。这些药物能相对减轻AD的症状,但都不能阻止病情的进展,因而疗效有限。所以,寻找治疗与预防AD的方法已成为世界所关注的问题。近年来高新技术的发展和应用,尤其是神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植技术的不断完善,给治疗AD提供了新的策略和契机。NSCs可以作为细胞供体,对于治疗一些中枢神经系统退行性疾病具有重要的临床意义。不过,至今为止无论是促进AD患者内源性神经细胞生成还是外源性干细胞移植,均未获得成功。其原因可能与AD患者颅内p-淀粉样蛋白(beta-amlyoid protein, Aβ)沉积引起的微环境改变有关。现有研究显示外周迷走神经受刺激后释放的胆碱能神经递质与巨噬细胞烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinc acetylcholine receptor, α7-nAChR)受体作用,可以抑制巨噬细胞炎性介质的合成与分泌,削弱外周炎性反应。我们前期研究已证明体外培养的小胶质细胞可表达α7-nAChR,Aβ在体外可诱导该细胞分泌炎性介质增加,而激活α7-nAChR可使Aβ介导的这些炎性介质生成和分泌降低。因此,明确Aβ介导的炎症反应能否造成NSCs失能以及激活a7-nAChR削弱炎症反应能否改善NSCs生存环境,促进其增殖、分化能力,减少其凋亡的研究具有非常重要的意义。基于上述研究,本课题将建立离体培养的NSCs体系及小胶质细胞与NSCs共培养体系,明确Aβ1-42作用的小胶质细胞对体外培养的NSCs生存的影响,进一步探讨预激活小胶质细胞a7-nAChR对Ap1-42介导的NSCs失能的保护作用；同时从分子水平上观察NSCs增殖分化过程中两类关键的Wnt信号途径调控分子β-Catenin和GSK-3p的动态变化,阐明Wnt/β-catenin信号途径对共培养体系中的NSCs增殖、分化过程中的具体调控作用。这给研究调控神经细胞生成的分子机制提供理论基础,为进一步揭示AD发病机制提供了技术支持,也为临床治疗AD提供新的理论基础。方法1.海马NSCs培养及鉴定新生SD大鼠海马组织中分离出细胞用含20ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor, bFGF)、20ng/ml EGF (epidermal growth factor, EGF)、2%B27、2%L-glutamine、1%青链双霉素的DMEM/F12培养液重悬后以1×106/ml接种于25cm2透气培养瓶内。置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养,每3-4d半量换液第7d结束原代培养并进行传代培养,每6-7d传代一次。取第3代NSCs进行nestin鉴定；第3代神经细胞球制备单细胞悬液,用10μmol/L5-溴-2脱氧尿嘧啶核核苷(5-bromo2-deoxyuridine, BrdU)标记检测细胞的增殖能力；第3代NSCs用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培养液进行正常分化处理,分化10d后分别行胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和微管相关蛋白-2(microtubule-associate protein, MAP-2)免疫细胞荧光染色鉴定细胞多向分化潜能。2.小胶质细胞培养新生SD大鼠海马组织中分离出细胞重悬于含10%FBS的DMEM/F12培养基中,单细胞悬液以5×105/ml细胞密度接种于预经多聚赖氨酸包被处理的75cm2透气培养瓶中,37℃、5%CO29孵育箱中培养2d后全量换液,待培养至9-10d,手摇法分离纯化小胶质细胞,并通过小胶质细胞特异性抗体CD11b/c进行免疫细胞化学检测,同时以DAPI对细胞核进行复染,以明确细胞总数,计算小胶质细胞纯度。3. Transwell共培养体系的建立及分组利用共培养小室(cell culture transwell inserts)建立NSCs和小胶质细胞的体外共培养模型。实验具体分组为：A.空白对照组(NSCs control):NSCs正常培养于上室,下室加培养基；B.Aβ1-42作用组(Aβ1-42+NSCs):NSCs培养于上室,下室加入终浓度为10μM Aβ1-42的培养基；C.共培养对照组(NSCs and Microglia Co-culture):NSCs与小胶质细胞以1：1的浓度比依次接种于上室和下室；D.Aβ1-42作用的共培养组(NSCs and Aβ1-42+Microglia Co-culture):NSCs与小胶质细胞以1：1的浓度比依次接种于上室和下室,同时小胶质细胞层加入终浓度为10M Aβ1-42。E.烟碱预激活的共培养组(NSCs and Nicotine+Aβ1-42+Microglia Co-culture): NSCs与小胶质细胞以1：1的浓度比依次接种于上室和下室；小胶质细胞层提前1h加入终浓度为10μM Nicotine预激活小胶质细胞后,再加入终浓度为10μMAβ1-42进行共培养；F.通路抑制对照组(Sulindac+NSCs and Microglia Co-culture):NSCs与小胶质细胞以1：1的浓度比依次接种于上室和下室,同时NSCs层加入终浓度为200nM Sulindac;G.Aβ1-42作用的通路抑制组(Sulindac+NSCs and Aβ1-42+Microglia Co-culture):NSCs与小胶质细胞以1：1的浓度比依次接种于上室和下室；NSCs层加入终浓度为200nM Sulindac,同时小胶质细胞层加入终浓度为10μMAp1-42;H.烟碱预激活的通路抑制组(Sulindac+NSCs and Nicotine+Aβ1-42+Microglia Co-culture):NSCs与小胶质细胞以1：1的浓度比依次接种于上室和下室；小胶质细胞层提前1h加入终浓度为10μM Nicotine预激活小胶质细胞后,再加入终浓度为10μM Aβ1-42;同时NSCs层加入终浓度为200nM Sulindac。4. BrdU掺入法检测NSCs增殖率神经细胞球制备成单细胞悬液,加入终浓度为10μM的BrdU标记24h后,细胞悬液按照实验分组情况分别进行加药处理。96h后,行BrdU免疫细胞荧光鉴定。5.免疫细胞化学检测NSCs分化能力神经细胞球用含10%FBS的DMEM/F12培养液进行正常分化处理5d后,按照实验分组情况分别进行加药处理。共培养96h后行MAP-2和乙酰胆碱酯酶(choline acetyltranferase, CHAT)免疫荧光染色。6.流式细胞仪分析NSCs凋亡率神经细胞球制备成单细胞悬液悬浮培养,然后按照实验分组情况分别进行加药处理。各组细胞经处理96h之后,参照Annexin V-FITC/PI检测试剂盒说明书进行前期处理后,上流式细胞仪检测。7. Western Blot检测NSCs中β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平神经细胞球分别进行增殖和分化处理,按照实验分组情况分别进行加药处理96h后,提取NSCs总蛋白,用免疫蛋白印迹(western blot)方法进行检测各组β-catenin及GSK-3p蛋白表达量。8.统计学处理所有统计分析均用SPSS16.0统计软件分析。数据均采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch法。组间两两比较时,若方差齐性,则采用最小显著性差异法(LSD法)；若方差不齐,则采用Dunnett’T3方法。P<0.05表示差异具有显著性意义,P<0.01表示差异具有非常显著性意义。结果1.NSCs培养与鉴定体外培养的NSCs以神经细胞球的形式增殖并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和BrdU染色阳性细胞,并能分化为神经元(MAP-2阳性细胞)和星形胶质细胞(GFAP阳性细胞)。2.小胶质细胞培养与鉴定原代混合培养的细胞主要是以星形胶质细胞为主,并含有小胶质细胞、神经元和少量的少突胶质细胞。细胞培养9-10d后出现分层现象后,通过手摇法分离纯化获得小胶质细胞。显微镜下观察：小胶质细胞胞体扁平或卵圆形,突起细长。经CD11b/c免疫荧光检测,阳性率在95%以上。3.成功建立NSCs和小胶质细胞的体外共培养模型。4. NSCs增殖情况BrdU掺入法检测数据显示,空白对照组中NSCs增殖率为77.10%,Aβ1-42直接作用后增殖率下降为52.99%,差异具有统计学意义(P<0.001)。单纯小胶质细胞与NSCs共培养时NSCs增殖率为73.53%,与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。但若在共培养基础上加入Aβ1-42作用于小胶质细胞后,可使NSCs增殖率仅为28.40%,下降显著(P<0.001)。若烟碱预先激活小胶质细胞a7-nAChR, Aβ1-42再作用于小胶质细胞,NSCs增殖率增加到51.58%,与空白对照组比较显著下降(P<0.001),但和Ap1-42作用的共培养组比较,显著回升(P<0.001)。用Sulindac抑制Wnt/β-catenin信号通路后,NSCs增殖率可由73.53%降至48.28%(P<0.01),若在此基础上加入Aβ1-42,NSCs增殖率进一步下降至29.64%(P<0.001),即使烟碱预先激活小胶质细胞a7-nAChR,也只能使NSCs增殖率增加至39.79%,差异无统计学意义(P>0.05)。5. NSCs分化情况数据显示,正常NSCs在血清培养条件下可分化成神经元和胆碱能神经元的比例为16.77%和5.60%；而Ap1-42作用后,神经元比例下降为10.82%,胆碱能神经元下降为2.90%(均P<0.001)。在共培养体系中,Aβ1-42对NSCs多向分化潜能的抑制作用增强,其中神经元的比例仅为6.16%,胆碱能神经元比例为1.53%；若烟碱预激活小胶质细胞a7-nAChR后,Aβ1-42抑制NSCs分化能力的作用减弱,此时神经元比例增加到10.69%(P<0.05),胆碱能神经元比例增加到2.51%(P<0.05)。用Sulindac抑制Wnt/p-catenin信号通路后,神经元比例从14.96%稍降至14.00%(P>0.05),而胆碱能神经元比例从3.52%显著降至2.80%(P<0.001)；若在此基础上加入Aβ1-42神经元及胆碱能神经元比例分别为10.15%及1.12%,变化不显著(均P>0.05)；此时激活小胶质细胞a7-nAChR使神经元比例增至11.28%(P>0.05),而胆碱能神经元比例显著增至1.98%(P<0.05)。6. NSCs凋亡情况流式细胞仪检测数据显示,在正常情况下培养的NSCs凋亡率为5.76%,Aβ1-42直接作用后凋亡率显著升高至25.77%(P<0.01)。在共培养体系中,静止状态的小胶质细胞对NSCs生存无显著影响作用,凋亡率为6.43%(P>0.05),而加入Aβ1-42作用于小胶质细胞后,NSCs凋亡率显著升高至45.19%(P<0.01)；若用烟碱预先激活小胶质细胞α7-nAChR,再用Aβ1-42作用于小胶质细胞可使凋亡率降至29.17%(P<0.01)。在共培养体系中,用Sulindac抑制Wnt/p-catenin信号后,NSCs凋亡率由6.43%增至24.07%；Aβ1-42可使体系中NSCs凋亡率由45.19%增至56.65%；若烟碱预先激活小胶质细胞a7-nAChR,再加入Aβ1-42作用于小胶质细胞,凋亡率由29.17%增至34.86%,凋亡率低于Aβ1-42作用的通路抑制组(P<0.01)。7. Wnt/β-Catenin信号通路对NSCs增殖的影响与共培养对照组比较,通路抑制对照组中β-catenin蛋白表达下调,但差异不具有统计学意义(P>0.05)；而GSK-3β蛋白表达上调且差异具有统计学意义(P<0.05)。与Aβ|-42共培养组相比,Aβ1-42通路抑制组中β-catenin表达大幅度下调,同时GSK-3p表达上调,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。与烟碱预激活组比较,抑制通路后烟碱激活小胶质细胞a7-nAChR,β-catenin表达稍微上调,但差异不具有统计学意义(P>0.05)；而GSK-3p表达上调,差异却具有统计学意义(P<0.01)。8. Wnt/β-Catenin信号通路对NSCs分化的影响与共培养对照组比较,通路抑制对照组中β-catenin蛋白表达下调(P<0.05),而GSK-3p蛋白表达上调(P<0.001)。与Aβ1-42作用共培养组相比,Aβ1-42通路抑制组中β-catenin及GSK-3β表达均下调,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。与烟碱预激活组相比,烟碱通路抑制组中β-catenin及GSK-3p表达均下调,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。结论1.应用Transwell小室在体外成功建立小胶质细胞与NSCs共培养体系。2.Aβ1-42能够直接抑制NSCs的增殖,促进其凋亡,减少其分化成神经元、胆碱能神经元的比例。3.Aβ1-42对神经细胞生存抑制的作用可能通过小胶质细胞而加强。4.激活小胶质细胞α7-nAChR可削弱共培养体系中Aβ1-42对NSCs的损伤作用,促进NSCs增殖分化。5.在小胶质细胞α7-nAChR激活削弱Aβ1-42介导NSCs失能体系中,Wnt/β-catenin信号通路对NSCs增殖、分化和凋亡情况有着许多不同的作用。