【摘 要】
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背景:在急性缺血性卒中（Acute ischemic stroke,AIS）发生时,脑细胞迅速缺血缺氧,使脑细胞更多地通过无氧代谢合成能量,导致组织内氧化应激水平升高。大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、炎症因子等毒性分子损伤血脑屏障（Blood-Brain Barrier,BBB）完整性,导致外周毒性细胞和分子进入大脑加重脑损伤。再灌注治疗也会因BBB的破坏出现
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背景:在急性缺血性卒中（Acute ischemic stroke,AIS）发生时,脑细胞迅速缺血缺氧,使脑细胞更多地通过无氧代谢合成能量,导致组织内氧化应激水平升高。大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、炎症因子等毒性分子损伤血脑屏障（Blood-Brain Barrier,BBB）完整性,导致外周毒性细胞和分子进入大脑加重脑损伤。再灌注治疗也会因BBB的破坏出现脑水肿和出血性转化的严重并发症。因此,减轻血管内皮细胞氧化应激引起的损伤,对于保护AIS血脑屏障功能、减轻神经功能损伤至关重要。近年来的研究发现1-磷酸鞘氨醇5受体（Sphingosine-1-phosphate-5 receptor,S1PR5）在多发性硬化体外模型、亨廷顿病动物模型等中枢神经系统疾病模型中可维持BBB完整性以及减轻内皮细胞的免疫炎症反应,均提示许多病理条件下,S1PR5在保护BBB的结构和功能中起着重要作用。但是S1PR5在AIS氧化应激损伤引起的BBB功能障碍中的作用及分子机制,目前仍不清楚。目的:探讨S1PR5在小鼠脑微血管内皮细胞（b End.3）氧化应激损伤过程中的作用及分子机制。方法:用CCK-8法检测细胞活力改变来筛选H2O2和A971432的适宜浓度。用siRNA转染b End.3细胞来敲低S1PR5表达,并用RT-q PCR检测siRNA敲低效率。分组:在特异性激动S1PR5的研究中,将b End.3细胞分为对照组（Control）、H2O2组、H2O2+5μmol/L A971432（S1PR5特异性选择性激动剂）组、H2O2+10μmol/L A971432组、H2O2+20μmol/L A971432组。在敲低S1PR5的研究中,将b End.3细胞分为对照组（Control）、H2O2组、siNC+H2O2组、si S1PR5+H2O2组。用FITC-Dextran渗透法检测血管内皮细胞通透性。用Western blot检测S1PR5、ZO-1、VE-Cadherin、Occludin、Bax、Bcl2、Caspase-3、p-Erk1/2、Erk1/2、Nrf2、HO-1、SOD1和SOD2的蛋白表达水平。用免疫荧光法观察ZO-1的荧光强度。在光学显微镜下观察细胞形态变化。用DCFH-DA探针法检测细胞内总ROS水平。结果:（1）与对照组相比,2 mmol/L H2O2处理b End.3细胞1.5 h,能显著降低细胞活力,增加血管内皮细胞通透性且减少与内皮通透性相关的连接蛋白ZO-1、VE-Cadherin、Occludin的表达,以及减少抗氧化蛋白Nrf2、HO-1的表达（P＜0.05）,是一种比较稳定的氧化应激损伤模型。与对照组相比,50μmol/L以下浓度（5、10、20μmol/L）的A971432单独处理对细胞活力均无明显影响（P＞0.05）,可用于后续实验。（2）Western Blot结果显示,与对照组相比,H2O2处理后b End.3细胞的S1PR5蛋白表达明显降低（P＜0.05）。（3）与H2O2组相比,A971432可以抑制H2O2诱导的内皮高通透性,增加连接蛋白ZO-1、VE-Cadherin、Occludin的表达,并且减少与内皮损伤相关的MMP-9的蛋白表达（P＞0.05）。A971432可以增加H2O2条件下的细胞膜上ZO-1荧光强度。（4）与H2O2组相比,A971432可以提高H2O2导致的细胞活力下降,可以降低凋亡相关蛋白Bax/Bcl2比值和Caspase-3表达（P＜0.05）。选取20μmol/L A971432研究,发现可以显著抑制H2O2诱导的Erk1/2磷酸化增加（P＜0.05）。显微镜下观察,A971432处理可以维持H2O2损伤下的细胞形态,减少漂浮。（5）与H2O2组相比,DCFH-DA探针法检测细胞内ROS水平显示,A971432处理可以降低细胞内总ROS水平,并且可以增加抗氧化分子Nrf2、HO-1、SOD1和SOD2的蛋白表达（P＜0.05）。（6）与siNC组相比,si S1PR5组显著增加血管内皮通透性,减少ZO-1、VE-Cadherin、Occludin的蛋白表达（P＜0.05）。与siNC+H2O2组相比,si S1PR5+H2O2组的内皮通透性均明显升高,si S1PR5+H2O2组ZO-1、VE-Cadherin、Occludin的蛋白表达显著下降（P＜0.01）。结论:A971432选择性激动S1PR5可减轻H2O2诱导的b End.3内皮细胞高通透性及凋亡,并可能通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化损伤作用。而下调b End.3细胞中S1PR5的表达,可以进一步加重H2O2诱导的血管内皮高通透性损伤。
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