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近年来,肿瘤免疫已成为肿瘤研究领域的热点;其中,针对免疫系统“刹车分子”CTLA-4和PD-1的研究成果获得了 2018年诺贝尔生理学或医学奖。迄今大量的研究显示,PD-1/PD-L1抑制剂在包括结直肠癌（colorectal cancer,CRC）在内很多实体瘤中,尤其是微卫星高度不稳定型（microsatellite instability-high）及高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden,TMB）的实体瘤中表现出理想的抗肿瘤效果,然而只有15%的微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）型CRC患者能从中受益。相比微卫星稳定（microsatellite stability,MSS）型CRC,MSI型CRC内浸润着大量淋巴细胞,应用PD-1/PD-L1抑制剂能重新恢复效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。目前认为,MSI型的恶性肿瘤浸润的免疫细胞较多主要是因为其具有较高的TMB;然而,相关研究显示在恶性黑色素瘤中,缺乏高突变负荷并不一定排除PD-1/PD-L1抑制剂治疗的临床反应,相反,高突变负荷的存在并不总是与临床反应相关。因此,除了高TMB外,应该还存在着许多其他因素调控肿瘤组织内免疫细胞的浸润;本研究拟从转录组层面揭示CRC组织中影响免疫细胞浸润的相关因素。我们首先利用公共数据库表达谱芯片GSE13294、TIMER网站分析CRC中MSI型和MSS型的差异表达基因与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的相关性,初步筛选出一个在MSS型CRC高表达、MSI型CRC低表达的Wnt信号通路靶基因——ASCL2基因。相关分析显示,随着ASCL2表达增高,CRC组织内CD8+T细胞、树突状细胞（DC）的浸润丰度反而降低;通路富集分析提示MSS型CRC主要存在Wnt信号通路活化;IHC结果也显示CRC石蜡组织Wnt信号通路活化、ASCL2高表达与CD8+T细胞浸润呈负相关作用。基于CRC统一分子亚型（consensusmolecularsub types,CMS）分型法我们做了进一步分析,结果显示在MSI型CRC中ASCL2低表达,该部分病人属于CMS1型,具有高甲基化、高突变、强免疫活化等特点,并且是PD-1/PD-L1抑制剂治疗的目标人群;而在MSS型CRC中ASCL2高表达,该部分病人大部分属于CMS2型,具有显著的Wnt信号通路活化的特点,对PD-1/PD-L1抑制剂治疗不敏感。以上分析结果提示,ASCL2基因在CRC中不同的表达模式与瘤组织内免疫细胞的浸润丰度、PD-1/PD-L1抑制剂疗效具有显著的相关性。相关文献显示,肿瘤内干性指数与免疫细胞浸润分数呈负相关,干性越强,免疫细胞浸润越少。在本研究中一系列体内外干性功能实验包括干细胞成球、SP侧群细胞分选、有限稀释细胞异种移植结果都表明ASCL2能促进CRC细胞干性特征。免疫功能正常的C57小鼠皮下瘤模型结果显示ASCL2促进皮下瘤的生长,并且ASCL2能够抑制瘤内CD8+T细胞、DC的浸润;而缺乏T细胞免疫功能的裸鼠皮下瘤模型结果显示ASCL2并不会影响肿瘤的生长。结果说明ASCL2是通过抑制瘤内CD8+T细胞和DC的浸润从而促进肿瘤的生长。上述研究结果提示,ASCL2基因有可能是通过调控CRC细胞干性进而影响免疫细胞的浸润。我们进一步利用全基因组表达谱芯片技术分析了 ASCL2基因调控肿瘤免疫细胞浸润的相关分子机制。结果发现,ASCL2干扰后CRC细胞株中上调的基因主要富集在NF-κB和TNF炎症相关信号通路,并且其中DDIT3和DDIT4基因表达明显上调;利用CHIP及双荧光素酶活性检测实验证明ASCL2抑制DDIT3和DDIT4的启动子活性;Western Blot实验表明ASCL2能够通过抑制DDIT3和DDIT4的表达从而抑制下游NF-κB和TNF信号通路的活性,减少炎细胞浸润。最后,我们还构建了 C57小鼠皮下瘤模型观察ASCL2对Wnt通路抑制剂XAV-939和anti PD-L1药物治疗效果的影响。比较小鼠肿瘤体积增长率（终末体积/用药前初始体积）发现MC38/shASCL2-合用药组肿瘤体积增长率显著低于MC38/NC-control组,说明在干扰ASCL2的情况下同时应用PD-L1抑制剂和Wnt信号通路抑制剂能够显著抑制肿瘤的生长速度;而MC38/shASCL2-单用anti PD-L1与MC38/shASCL2-合用药组之间差别不大,说明在干扰ASCL2的情况下,应用Wnt信号通路抑制剂对肿瘤生长并没有太大的抑制作用。流式分析各组小鼠瘤内CD8+T细胞和DC的浸润丰度,其结果显示MC38/shASCL2-单用anti PD-L1与MC38/shASCL2-合用药组之间CD8+T细胞浸润程度没有明显差异,且MC38/NC-control组浸润的CD8+T细胞和DC显著低于MC38/shASCL2-单用anti PD-L1与MC38/shASCL2-合用药组;免疫组化分析肿瘤石蜡切片结果和流式分析结果一致,说明ASCL2能够通过抑制瘤内CD8+T细胞和DC的浸润从而抑制anti PD-L1 的疗效。本研究深入探讨了 ASCL2基因在CRC组织中的不同的表达模式,以及该基因表达对CRC干细胞特征和对PD-1/PD-L1抑制剂耐药的作用及分子机制。我们发现了一个PD-1/PD-L1抑制剂在CRC中耐药的新的分子机制,即ASCL2在CMS2型CRC中受Wnt信号通路调控持续表达增高,促进CRC细胞干性,抑制瘤组织内CD8+T细胞和DC的浸润,从而降低PD-1/PD-L1抑制剂的疗效。该研究有望为CMS2型（微卫星稳定型,MSS）结直肠癌患者在临床上能够采用PD-1/PD-L1抑制剂治疗提供一个新的联合应用策略,进一步拓展PD-1/PD-L1抑制剂治疗的适用人群。