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目的:越来越多的研究发现肿瘤浸润NK细胞处于功能失调状态,解除肿瘤微环境的免疫抑制因素可有效增强NK细胞的抗肿瘤功能,并恢复抗肿瘤免疫。我们前期研究结果发现胃癌间充质干细胞（gastric cancer mesenchymal stem cells,GCMSCs）作为肿瘤微环境中的重要成分具有较强的免疫抑制功能,并促进肿瘤进展,但其是否影响NK细胞功能进而抑制抗肿瘤免疫尚不明确。本研究旨在探究GCMSCs对NK细胞功能的影响及其机制,为建立恢复肿瘤浸润NK细胞抗肿瘤免疫功能的有效策略提供新的思路。方法:磁珠分选富集健康人外周血NK细胞（CD56+）,流式抗体染色进行NK细胞纯度鉴定。使用贴壁法分别从新鲜胃癌组织和健康人骨髓组织中分离获得GCMSCs和骨髓间充质干细胞（BMMSCs）,通过细胞形态学,流式细胞术检测表面标记物,成脂、成骨诱导分化实验对其进行鉴定。收集GCMSCs条件培养上清（GCMSCs condition medium,GCMSC-CM）体外作用于NK细胞,并流式细胞术检测NK细胞效应功能相关分子,杀伤实验检测NK细胞细胞毒性,CCK-8实验和凋亡染色实验分别检测NK细胞增殖和凋亡。尾静脉过继人外周血NK细胞构建免疫系统人源化小鼠模型,流式细胞术、免疫组化检测皮下瘤组织浸润NK细胞数量和功能。免疫组化检测胃癌细胞增殖、凋亡指标。Western-blot检测GCMSCs、BMMSCs和胃癌细胞CD39表达,生物信息学分析人胃癌组织及正常组织CD39表达及与预后相关性。CD39抑制剂（POM-1）处理GCMSCs(GCMSCsCD39-)并使用Western blot检测CD39表达,流式细胞术、细胞杀伤实验检测GCMSCsCD39-处理后的NK细胞效应功能。q RT-PCR检测NK细胞四种腺苷受体,通过使用腺苷受体(A2A)抑制剂（AZD4635）处理和ELISA试剂盒检测单磷酸腺苷（AMP）证明腺苷在GCMSCs/NK细胞共培养体系中的作用。人源化小鼠模型验证阻断CD39信号在NK细胞免疫功能及免疫治疗中的作用。结果:（1）体外成功分离、鉴定GCMSCs和BMMSCs。使用新鲜收集的GCMSC-CM分别处理磁珠分选的健康人外周血富集NK细胞和NK92细胞。相比于对照组,流式细胞术检测分析发现GCMSC-CM处理后的NK细胞CD107a、Perforin、IFN-γ和Granzyme B表达水平显著下调,且其对肿瘤细胞的杀伤能力显著减弱,NK细胞处于功能耗竭状态。然而,CCK-8检测结果显示GCMSC-CM不显著改变NK细胞增殖能力,而且Annexin V/PI双染实验显示GCMSC-CM处理不显著影响NK细胞凋亡,western blot结果表明GCMSC-CM处理可显著下调NK细胞m TOR信号。另一方面,western blot结果显示GCMSCs/NK细胞共培养可分泌更高水平TGF-β和IL-10。进一步研究发现与GCMSCs共培养同样可以显著抑制NK细胞功能。腹腔注射人PBMCs成功构建免疫系统人源化小鼠模型,结果显示GCMSC-CM处理的小鼠肿瘤体积显著增大,皮下瘤组织NK细胞浸润数量减少、效应功能减弱。（2）免疫组化染色显示CD39在人胃癌基质成分呈阳性。生物信息学分析结果显示人胃癌组织较正常组织CD39显著上调,且CD39阳性病人预后更差。与BMMSCs相比,GCMSCs显著高表达CD39。腺苷（Adenosine,ADO）处理可显著抑制NK细胞效应功能。CD39抑制剂（POM-1）处理有效逆转了GCMSCs对NK细胞功能的抑制作用。q RT-PCR检测发现NK细胞上腺苷受体A2A表达明显高于其他三种受体。使用A2A选择性抑制剂（AZD4635）处理逆转了GCMSCs对NK细胞效应功能的抑制作用。ELISA检测发现GCMSCs/NK细胞共培养上清AMP含量显著高于BMMSCs/NK共培养上清。瘤周注射GCMSCsCD39-体外预处理的NK细胞,小鼠皮下瘤较GCMSCs预处理NK细胞组体积明显缩小。尾静脉过继健康人NK细胞人源化小鼠模型进一步发现POM-1腹腔给药显著逆转了GCMSCs对肿瘤浸润NK细胞数量和功能的抑制作用,免疫组化染色表明POM-1处理显著降低肿瘤组织Ki67+细胞百分比。结论:GCMSCs通过旁分泌途径抑制NK细胞功能耗竭及抗肿瘤免疫,这种效应功能的减弱依赖于GCMSCs对NK细胞代谢的影响。GCMSCs上高表达的CD39水解ATP导致免疫抑制分子腺苷聚集,腺苷通过与NK细胞上A2A受体作用导致NK细胞功能耗竭。阻断GCMSCs上CD39表达可以有效恢复NK细胞抗肿瘤功能并显著提高肿瘤浸润NK细胞数量,抑制肿瘤生长。CD39-A2A腺苷轴是GCMSCs诱导NK细胞功能耗竭的关键途径。本研究为胃癌免疫治疗提供了一个潜在的联合治疗靶点。