【摘 要】
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瘦素（Leptin）是一种由肥胖基因（Obese,ob）编码的蛋白质类激素,其主要由白色脂肪细胞分泌。瘦素蛋白（Obese,OB）通过与瘦素受体蛋白（Obese receptor,OBR）结合实现生物调节功能,OB可通过对下丘脑神经元调节动物摄食行为、能量代谢和生殖内分泌,更是维持哺乳动物正常生殖活动的关键因子。本文主要探究OB和OBR在绵羊公羊生殖系统中的免疫定位;通过外源处理的方式探究OB对绵
【基金项目】
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新疆维吾尔自治区科技援疆项目“黑萨福克与多浪羊杂交改良与快速繁育技术研究与应用”的部分研究成果（项目编号:2016E02037）
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瘦素（Leptin）是一种由肥胖基因（Obese,ob）编码的蛋白质类激素,其主要由白色脂肪细胞分泌。瘦素蛋白（Obese,OB）通过与瘦素受体蛋白（Obese receptor,OBR）结合实现生物调节功能,OB可通过对下丘脑神经元调节动物摄食行为、能量代谢和生殖内分泌,更是维持哺乳动物正常生殖活动的关键因子。本文主要探究OB和OBR在绵羊公羊生殖系统中的免疫定位;通过外源处理的方式探究OB对绵羊精子参数和睾丸支持细胞的影响及其机制,为绵羊繁殖和育种工作提供有实用价值的理论依据。（1）本实验研究了OB和OBR在白萨福克公羊生殖系统的定位。绵羊精浆中瘦素生理浓度为1.81 ng/m L～2.47 ng/m L,血清瘦素浓度为1.83 ng/m L～3.21 ng/m L。通过RT-q PCR、免疫荧光和Western blot证实了睾丸、附睾和精子中瘦素和瘦素受体的存在。在睾丸中,OB在初级和次级精母细胞中高度表达,OBR在次级精母细胞中高度表达。在附睾中,我们观察到OB表达在附睾各部位的静纤毛区,而OBR仅表达在附睾体、尾的静纤毛区;OB仅表达在附睾头、尾柱状细胞,而OBR表达在附睾各部位的柱状细胞,附睾腔中可见可溶性OBR表达。RT-q PCR结果表明,与射出的精子相比,附睾中精子的OB和OBR基因表达水平显著增加（P＜0.01）。（2）研究不同浓度Leptin（0 ng/m L、3 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L、100 ng/m L）对绵羊精子参数的影响。采集1～2岁龄的白萨福克绵羊精液,利用计算机辅助分析系统（CASA）分析精子活力情况。结果显示,5 ng/m L Leptin显著提高了精子的快速前向运动能力（PR）、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）、平均路径运动速度（VAP）（P＜0.01）,5 ng/m L Leptin处理2 h是外源添加处理精子的最佳浓度和处理时间。后续评估精子功能试验以5 ng/m L做为外源处理组,结果表明,瘦素可以显著提高精子活力（P＜0.01）、存活率（P＜0.05）、线粒体膜电位（MMP）（P＜0.01）、显著降低精子DNA碎片率（DFI）（P＜0.01）和活性氧（ROS）（P＜0.01）,然而,其对受精过程,诱发顶体反应的能力和顶体完整性没有影响（P＞0.05）。单精子转录组分析表明,5 ng/m L瘦素处理后显著上调213个基因,显著下调163个基因,其中大部分为能量代谢和免疫相关的信号通路。以上研究显示,5 ng/m L瘦素外源处理能够显著减少绵羊精子外部氧化应激,并维持膜完整性。（3）探究了不同浓度Leptin（0 ng/m L、3 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L、100 ng/m L）对绵羊睾丸支持细胞的影响。采集绵羊睾丸组织,原代培养、分离纯化、鉴定,培养第4代细胞做细胞增殖、周期、凋亡等关实验。结果表明,100 ng/m L瘦素处理可以显著提高睾丸支持细胞增殖并提高cAMP浓度,另外,其对细胞周期有显著影响,能够显著提高S期所占比例,还显著降低支持细胞凋亡率。转录组学分析表明,100 ng/m L瘦素处理支持细胞后,共上调125个基因,下调138个基因,主要富集在与细胞增殖、活力和分化过程相关的信号通路中。非靶向LC-MS/MS的代谢组学分析表明,100ng/m L瘦素处理支持细胞后共有183种代谢物存在显著差异,其中53种代谢物上调和130种代谢物下调,共富集了94条代谢途径,主要涉及脂类、碳水化合物和氨基酸代谢。转录-代谢整合分析表明,100 ng/m L瘦素外源处理可显著影响细胞增殖和分化的信号通路及其相关的代谢物。综上所述,本研究为绵羊睾丸、附睾和精子中OB和OBR的免疫定位提供了新的证据。5 ng/m L外源瘦素处理能显著提高精液品质,100 ng/m L外源瘦素处理能显著促进睾丸支持细胞增殖与分化。
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