论文部分内容阅读
针对程序性死亡受体（Programmed death receptor 1,PD-1）/程序性死亡配体（Programmed death ligand 1,PD-L1）的免疫检查点阻断疗法可在多种类型的癌症中引发显著的临床反应。尽管PD-1/PD-L1阻断疗法已经取得了相当大的成功,然而,单一的PD-1/PD-L1阻断疗法,往往仅在小部分患者体内起作用,且容易引发自身免疫性疾病等毒副作用。造成这种现象的原因主要有三个方面。第一,PD-1/PD-L1阻断剂缺乏靶向性。PD-1/PD-L1阻断剂的全身给药,往往不具备选择性,容易在机体发生非特异性结合,引起腹泻,呕吐和结肠炎等形式的自身免疫症状,而肿瘤病灶中PD-1/PD-L1阻断效率相对较低,使得抗肿瘤效果不明显。第二,肿瘤微环境中T细胞浸润不足。肿瘤组织中足量的T细胞浸润是PD-1/PD-L1阻断治疗的必要条件,否则,即便PD-1/PD-L1阻断剂能够成功进入肿瘤组织,也无法有效激活抗肿瘤特异性免疫反应。第三,肿瘤细胞低免疫源性。能够逃脱免疫监控并最终发展成为成熟肿瘤组织的肿瘤细胞普遍具有较低免疫原性,因而,尽管PD-1/PD-L1阻断疗法能够成功解除针对T细胞的免疫抑制信号,免疫系统仍然无法有效识别和杀死肿瘤细胞。第四,免疫疗法的治疗效果通常受整个免疫抑制网络的影响,单一PD-1/PD-L1阻断疗法可能无法有效激活抗肿瘤免疫反应。针对这些问题,本课题提出了二种联合治疗策略,以提高基于PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫治疗效果。首先,本课题制备了脂质体介导的PD-L1拮抗肽和Cp G ODNs靶向共递送系统。通过Cp G ODNs的靶向递送,激活肿瘤组织中M2型巨噬细胞,促进促炎症细胞因子的释放,以激活肿瘤免疫微环境,同时实现PD-L1阻断剂的肿瘤靶向递送,进行共同抗肿瘤的作用。进而,我们构建了基于PD-1/PD-L1阻断和铁死亡的肿瘤联合治疗共递送系统。通过铁金属配合物的肿瘤靶向递送,可引发肿瘤细胞发生铁死亡,释放肿瘤相关抗原,刺激抗肿瘤特异性免疫反应;另外,巨噬细胞对铁金属配合物的胞吞作用,可有效激活巨噬细胞,逆转免疫抑制微环境;再者,铁金属配合物可作为阳离子基因载体介导PD-L1 trap质粒的靶向递送和肿瘤组织原位表达,实现肿瘤靶向PD-1/PD-L1通路阻断。通过上述二种给药系统的构建,希望在一定程度上弥补PD-1/PD-L1阻断抗肿瘤治疗的不足,为改善基于PD-1/PD-L1阻断的联合抗肿瘤治疗,提供新的思路。在论文第二章,我们通过薄膜分散法制备了甘露糖（M）修饰的阳离子脂质体（Lipo）,用于介导Cp G ODNs的巨噬细胞靶向递送;同时将PD-L1拮抗肽（P）通过基质金属蛋白酶（MMPs）响应的八肽序列接枝到脂质体表面,最后利用透明质酸（HA）对脂质体复合物进行包裹,获得PD-1/PD-L1阻断剂与免疫佐剂Cp G ODNs靶向共递送系统HA/M-Lipo Cp G-P。实验表明,该阳离子脂质体能够有效包封Cp G ODNs分子,形成粒径为230 nm左右的椭球形纳米粒;HA可通过静电吸附作用包裹在阳离子脂质体表面,以屏蔽阳离子脂质体表面正电荷;血清稳定性及溶血实验表明,HA涂层可以改善阳离子脂质体的血清稳定性,并降低溶血率。巨噬细胞内吞实验表明,阳离子脂质体能够介导高效的Cp G ODNs细胞内吞,且甘露糖和透明质酸修饰能够进一步促进Cp G ODNs的内吞效率;HA/M-Lipo Cp G-P脂质体复合物能够促进巨噬细胞分泌和释放一氧化氮（NO）,IL-6,IL-12及肿瘤坏死因子（TNF-α）等;通过对巨噬细胞表面标志性分子进行分析发现,HA/M-Lipo Cp G-P能够上调巨噬细胞表面CD80和诱导型一氧化氮合酶（i NOS,M1型巨噬细胞标志分子）的表达,并下调精氨酸酶（Arg-1,M2型巨噬细胞标志分子）的表达,说明了HA/M-Lipo Cp G-P在激活巨噬细胞和促进其M2表型向M1转化方面的重要作用。PD-1/PD-L1阻断实验结果表明,含有PD-L1拮抗肽的脂质体复合物M-Lipo Cp G-P能够有效阻断FITC-PD-1重组蛋白与肿瘤细胞表面的PD-L1配体结合。小鼠活体成像研究显示,M-Lipo Cp G-P和HA/M-Lipo Cp G-P脂质体复合物在体内均具有良好的肿瘤靶向性,而HA/M-Lipo Cp G-P组肿瘤组织中荧光信号更为持久,表明HA涂层可显着改善M-Lipo Cp G-P脂质体复合物在肿瘤组织内的蓄积。体内抗肿瘤实验结果表明,HA/M-Lipo Cp G-P治疗组在延缓肿瘤生长方面的效果最为显著;通过对小鼠肿瘤组织进行免疫分析发现,HA/M-Lipo Cp G-P治疗能够促进肿瘤组织中i NOS的表达,同时降低Arg-1,这一结论与体外实验一致;同时HA/M-Lipo Cp G-P脂质体复合物治疗能够增加肿瘤组织中CD4+T细胞的百分比,说明HA/M-Lipo Cp G-P脂质体复合物能够促进肿瘤组织中M2型巨噬细胞向M1转化,逆转肿瘤免疫抑制微环境,激活抗肿瘤免疫。在论文第三章,我们通过聚乙烯亚胺（PEI）与Fe3+配位获得Fe/PEI金属配合物;电感耦合等离子质谱仪（ICP）分析显示,铁离子含量为10%;进一步我们构建了含有细胞穿膜肽（TAT）和细胞核定位信号肽（NLS）的双功能肽（命名为Tn）,并将其修饰到Fe/PEI金属配合物表面,获得双功能肽Tn修饰的金属配合物Fe/PEI-Tn（Fe:3.5%）。一方面,Fe/PEI-Tn金属配合物可作为基因载体,介导PD-L1trap质粒基因的肿瘤特异性递送,实现PD-L1 trap蛋白在肿瘤组织内部原位表达,并持续释放至肿瘤微环境中,以干扰T细胞表面内源性PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1间相互作用。另一方面,Fe/PEI-Tn配合物本身可作为Fe3+储库,通过体内的靶向递送,特异性地增加肿瘤组织中巨噬细胞内Fe3+的含量,激活巨噬细胞,逆转促肿瘤的M2型巨噬细胞向M1转化,从而逆转肿瘤免疫抑制微环境;再者,肿瘤细胞内Fe3+超载可触发Fenton反应产生ROS,并诱导肿瘤细胞铁死亡。受损伤的肿瘤细胞可以将肿瘤特异性抗原释放到肿瘤微环境中,以刺激抗肿瘤免疫反应;同时Fe3+在酸性条件下,可催化H2O2分解产生氧气,缓解肿瘤组织低氧状态,从而抑制肿瘤的恶性进展。凝胶电泳实验表明,Fe/PEI-Tn能够有效缩合PD-L1 trap质粒DNA,形成粒径约为178 nm的类球形纳米粒;同样,我们也对Fe/PEI-Tn/PD-L1 trap复合物进行HA包覆,以延长其体循环时间,促进其在肿瘤部位的蓄积。溶血实验表明,HA/Fe/PEI-Tn/PD-L1 trap复合物具有良好的血液相容性。Fe/PEI-Tn配合物处理巨噬细胞,能够有效激活巨噬细胞,促进ROS,NO,IL-6和TNF-α等细胞因子的释放,并上调M1型巨噬细胞标志性分子的表达和下调M2型巨噬细胞标志性分子的表达;通过对Fe/PEI-Tn处理的4T1细胞进行分析发现,Fe/PEI-Tn配合物能够引发细胞内ROS和过氧化脂质（LPO）水平升高,促进谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）的消耗,同时诱导钙网蛋白（CRT）,高迁移率族蛋白HMGB-1,热休克蛋白HSP90和ATP等物质的释放。此外,Fe/PEI-Tn能够有效介导GFP报告基因和PD-L1 trap质粒基因的转染,且双功能肽Tn和HA能够在一定程度上增加二种基因的转染效率。Fe/PEI-Tn能够在体外催化H2O2分解产生氧气,并显著降低细胞内H2O2的水平;通过荷瘤小鼠体内实验也证明,Fe/PEI-Tn能够在一定时间内降低肿瘤组织中H2O2的水平,并下调肿瘤组织中低氧诱导因子（HIF-α）的表达;小鼠体内成像实验表明,HA/Fe/PEI-Tn/PD-L1 trap复合物具有明显肿瘤靶向性;Fe/PEI与p PD-L1 trap联合作用显示出比Fe/PEI更明显的肿瘤抑制作用;双功能肽Tn可能也对体内抑制肿瘤生长有积极作用;HA/Fe/PEI-Tn/p PD-L1 trap组抑瘤效果最好,这可能与HA在延长复合物体循环时间方面的作用有关;进一步对肿瘤组织进行分析发现,HA/Fe/PEI-Tn/PD-L1 trap复合物可逆转肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞表型,提高M1型巨噬细胞的比例,并增加肿瘤组织中CD4+T细胞的浸润。本课题构建了二种基于PD-1/PD-L1阻断的多功能药物递送系统,通过对药物递送系统结构优化,旨在实现PD-1/PD-L1阻断剂的靶向递送,同时从多方面激活机体抗肿瘤免疫反应,逆转肿瘤免疫抑制微环境,提高基于PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫治疗效果。该课题为基于PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤联合治疗提供了新的思路。