迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是水产养殖业常见的病原菌，它可以感染许多重要的经济鱼类。爱德华氏菌病的爆发导致养殖动物大规模的死亡，从而对水产养殖业造成重大损失。目前为止，对E. tarda致病因子的研究涉及到了各个方面，包括鞭毛蛋白、侵袭素、脂多糖、溶血素、糖基转移酶、III型/VI型分泌系统、铁载体、QseB-QseC双组分系统等等，但是关于其具体的致病机制还没有一个定论。目前在水产养殖业，抗生素仍然是对抗爱德华氏菌病的主要方法，这极易导致抗性菌株的产生，使其今后的防治工作更加难以进行。因此，彻底了解其致病机制，开发有效疫苗的工作迫在眉睫。荚膜是病原菌的重要毒力因子，它可以促进细菌粘附于宿主细胞表面，同时也可以保护细菌免受宿主免疫系统的杀伤。本实验室之前的研究工作发现，正常培养条件下E. tarda不具备明显的荚膜结构，但是在侵染牙鲆巨噬细胞后，从巨噬细胞内裂解出的细菌却具有了荚膜，因此我们推测荚膜的产生可能与E. tarda的致病性相关。本论文选取三个荚膜多糖合成相关基因，即Rcs双组分调控系统的应答调节子rcsB、可拉酸合成途径中的糖基转移酶wcaJ以及可拉酸合成途径中的甘露糖-1-磷酸核苷酸转移酶cpsB，作为研究对象，利用基因敲除的方法研究三者与致病性的关系。本研究首先利用自杀质粒pRE118介导的同源重组构建了以上三个基因的框内缺失突变株，即以E. tarda EIB202基因组DNA为模板，克隆了待敲除基因的上下游片段，且上下游片段具有12bp左右的重叠区；利用overlap PCR将上下游片段连接起来，导入自杀质粒pRE118；将构建好的自杀质粒导入接合菌株大肠杆菌S17-1,并与野生菌株E. tarda EIB202混合培养，经过两次同源重组，根据自杀质粒上的sacB基因使用含20%蔗糖的平板培养基筛选得到基因缺失的突变株。然后将含有缺失基因全长的低拷贝质粒pACYC184K转入缺失突变株中构建了互补菌株。缺失突变株及互补株构建成功后，使用荧光定量PCR检测缺失基因在互补株中的表达情况，确认其可表达后，通过比较野生株与突变株之间致病性相关表型的差异（如生物被膜形成能力、脂多糖形成能力、细菌的自凝能力、细胞的吸附率与内化率、对斑马鱼胚胎的毒力等），推测该基因在致病过程中所发挥的作用。本研究的主要结果如下：（1）以E. tarda EIB202为实验菌株，pRE118为自杀质粒，pACYC184K为互补质粒，构建了Rcs双组分调节系统的应答调节子基因rcsB的框内缺失突变株（ΔrcsB）及互补株（ΔrcsB (pACYC184K-rcsB)）。通过一系列的毒力相关表型实验发现：与野生株E. tarda EIB202相比，框内缺失突变株ΔrcsB对EPC细胞及斑马鱼胚胎的毒力有了明显的上升，自凝能力有了明显的提高，但是细菌的生长趋势及生物被膜形成能力却被降低。以上毒力相关表型在互补菌株中均有一定的回复，证明了突变性状是由rcsB的缺失导致的。由此推测，rcsB作为Rcs双组分系统的应答调节子，在细菌的生长、生物被膜的形成、自凝能力以及对EPC细胞及斑马鱼毒力等过程中均发挥了重要作用。此外，本实验还证实了基因缺失对细菌毒力的影响与对细菌的生长、生物被膜形成能力的影响并不一定是正相关的关系，衡量细菌的毒力不能仅依赖几个体外表型实验的结果。（2）通过框内缺失突变技术构建了E. tarda EIB202的可拉酸合成途径中糖基转移酶wcaJ框内缺失突变株（ΔwcaJ），并将带有wcaJ基因全长的低拷贝表达质粒pACYC184K导入ΔwcaJ构建了相应的互补株（ΔwcaJ (pACYC184K-wcaJ)）。研究结果表明，wcaJ基因的缺失使得EIB202的生物被膜形成能力、脂多糖的形成能力、对EPC细胞及斑马鱼胚胎的毒力均有所降低，以上表型在互补株中均有一定的回复，证明了突变性状是由wcaJ的缺失导致的。以上实验结果也表明了WcaJ在E. tarda生长、生物被膜形成、脂多糖形成、致病力的发挥中均有一定的作用。（3）通过框内缺失突变技术构建了E. tarda EIB202的可拉酸合成途径中甘露糖-1-磷酸核苷酸转移酶cpsB框内缺失突变株（ΔcpsB），同时构建了相应的互补菌株ΔcpsB(pACYC184K-cpsB)。研究结果表明，cpsB基因的缺失同样使得EIB202的生物被膜形成能力、脂多糖的形成能力、对EPC细胞及斑马鱼胚胎的毒力有所降低，但是细菌的生长趋势变化不大。以上表型在互补株中均有一定的回复，证明了表型的变化是由cpsB导致的。由以上结果推测：cpsB在E. tarda细菌的生物被膜形成、脂多糖形成及对EPC和斑马鱼胚胎的侵染上均发挥作用，而对其生长无明显影响。本研究首次报道了E. tarda荚膜多糖相关基因与其致病性的关系，为E. tarda致病机制的研究奠定了基础。