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醇腈酶(hydroxynitrile lyase,HNL;Oxynitrilase,E.C.4.1.2.x),作为一种生物催化剂,能可逆地催化氰化氢(HCN)和醛或酮类化合物反应生成手性氰醇化合物或手性药物。根据其催化产物的结构类型,HNL分为R型和S型。目前,两种类型HNL在工业上均得到了广泛的应用。在自然界中,IHNL主要作为有机体的一种裂解酶用于分解醇腈而产生HCN,该过程称为生氰作用。植物体内由于HNL对氰醇的生物催化反应释放出HCN,主要用于抵御食草动物、真菌的侵袭和机械破坏。此外,氰醇作为生氰的糖苷主要用来储存氢氰酸,同时参与氮源的转运和新陈代谢。尽管目前已报道的产氰植物超过有4000种。作为HNL催化反应的副产物,HCN被认为最多的是与抑制线粒体修复途径中的末端细胞色素氧化酶活性有关。不过越来越多的数据表明,HCN可能在植物的许多生理过程中起到调节作用(包括种子萌发、硝酸盐吸收及响应外界环境刺激等)。最近,通过序列比对及分析,拟南芥中报道了一个具有α/β水解酶活性的R型HNL(AtHNL),且具有较高的催化活性和对映体选择性而具有较高的工业应用前景。上述结果暗示传统的非生氰植物中可能存在酶促产生HCN的途径。此外,基因芯片结果表明,AtHNL基因显著的受冷害、NaCl及干旱胁迫的诱导表达,不过AtHNL是否存在诱导调节机制,其上游启动子序列中是否存在受逆境胁迫调控的元件需要进一步的阐述。此外,AtNNL基因是否在非生物胁迫中起到调控作用也需要深入研究。因此,本研究通过克隆和分析AtNNL启动子序列,通过转基因拟南芥,及结合非生物胁迫和激素处理下启动子的表达调控模式研究,为加深和理解AtHNL基因的调节机制,并对AtHNL在植物响应外界环境刺激中可能起到的作用提供一定的理论研究意义。此外,本研究还对AtHNL启动子中可能存在新的顺式作用元件进行发掘。在本研究中,为了研究AtHNL启动子的表达特征,我们首先克隆了长约2.1 kb的AtNNL启动子序列(pHNL,-2023至+67),以及pHNL的一系列相关5’缺失的片段(5D1,-933 到+67;5D2,-733 到+67;5D3,-533 到+67;5D4,-333到+67;5D5,-133到+67);通过构建表达载体,将所有克隆到的启动子片段融合到GUS(β-glucuronidase)基因的上游后,用浸花法转化拟南芥获得的转基因植株,用于分析外界刺激(尤其是干旱、高盐和冷胁迫)及激素处理对AtNNL启动子调控表达的影响。结果表明:pHNL能够响应盐胁迫,冻害及茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导。这可能与启动子序列中含有的环境胁迫诱导及茉莉酸响应元件有关;此外,AtHNL启动子还明显受干旱、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)不同程度的负调控表达,这可能与启动子中的CGTCA-motif,TATC-box,GARE-motif,TCA-element等关键作用元件的分布有关。此外,序列截短实验表明:5D1、5D2、5D4和5D5转基因拟南芥GUS活性较pHNL高;而5D3片段转基因拟南芥GUS活性基本检测不到,暗示-2023至-933及-533至-333的pHNL序列中包含有负责顺式调控作用的元件。进一步,结合非生物胁迫及激素处理,对不同长度AtNNL启动子序列的表达调控模式进行了分析,结果表明:部分胁迫处理下,不同的启动子缺失表达模式相似,部分长度启动子表达模式在同一处理下差异明显,暗示AtNNL启动子受调控的作用方式复杂。上述结果为深入探明和发掘AtHNL启动子受诱导模式及关键作用元件提供了一定的理论基础。