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肿瘤的生长依赖于血管营养的供给,血管新生通常涉及到细胞增殖和迁移,而PI3K/Akt/mTOR信号通路可以通过调控细胞增殖、存活、迁移影响肿瘤血管生成,因此阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路可抑制肿瘤血管新生,进而抑制肿瘤的生长。PI3K/Akt/mTOR通路是蛋白翻译过程中重要的调节通路,在恶性肿瘤中过度激活,其下游蛋白翻译起始因子的磷酸化可以调控肿瘤相关mRNAs(Cyclin D1、c-myc、Bcl-2、VEGF等)的翻译,参与肿瘤的发生发展。mTOR通路下游的抑癌基因4E-BP1通过与eIF4E形成复合体,进而减少eIF4E与eIF4G的结合(Erk可以促进该复合物的形成),此时翻译起始。在抗肿瘤药物的研究中通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路下游的蛋白质翻译相关蛋白或者抑制eIF4E与eIF4G的相互作用,抑制肿瘤细胞增殖,引起细胞凋亡。在抗血管抗肿瘤的药物研究过程中,除靶向血管生成外,可通过对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制,靶向关键调控蛋白或翻译相关蛋白,影响肿瘤的增殖和生长过程。本课题前期通过鸡胚尿囊膜模型筛选出具有抗血管生成活性的ZJQ-24,同时发现ZJQ-24能够抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞的增殖和迁移,进一步验证了其抗血管生成活性,但ZJQ-24抗肿瘤活性及其机理尚不清楚。本研究首先通过MTT实验检测吲哚酰胺类化合物ZJQ-24对肿瘤细胞的毒性,ZJQ-24对肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7、前列腺癌细胞PC-3和肺腺癌细胞 A549 的 IC50 值分别是 3.54±0.38μM、7.83±0.44μM、8.05±0.12μM 和17.63±1.08μM,且ZJQ-24对肝癌细胞的杀伤作用最明显,所以选择HepG2细胞研究ZJQ-24的作用机理。接下来研究ZJQ-24对HepG2细胞周期的影响。ZJQ-24按浓度梯度(1μM、5μM、10μM;24h)处理 HepG2 后,5μM 的 ZJQ-24 可诱导 HepG2 细胞 G2/M期阻滞。因此选择浓度为5μM ZJQ-24进行时间梯度(6h、12h、24h、48h)的HepG2细胞周期检测,发现ZJQ-24处理HepG2细胞12h后出现明显的G2/M阻滞;随着作用时间的延长(24h、48h),HepG2细胞出现G1期阻滞。采用Annexin V/FITC染色法和Western Blot方法检测ZJQ-24对HepG2细胞凋亡的作用,发现ZJQ-24(5μM,24h)能够引起HepG2细胞的早期凋亡,而对HUVEC细胞的凋亡作用不明显。提示ZJQ-24能够抑制HepG2细胞增殖、诱导细胞凋亡,且具有良好的药物选择性。进一步研究ZJQ-24对PI3K/Akt/mTOR通路的影响。研究发现5μM ZJQ-24可以降低 PI3K/Akt/mTOR 通路中 p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、Raptor(mTORC1)、p-PRAS40(Thr246)、p-PRAS40(Ser183)、p-P70S6K(Thr389)、p-S6(Ser240/244)蛋白表达量。推测ZJQ-24可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制HepG2增殖、蛋白翻译,从而诱导细胞凋亡。在对PI3K/Akt/mTOR信号通路下游翻译调控基因的研究中,发现ZJQ-24对翻译调控基因Bcl-2、Cyclin D1的转录水平影响不明显,但可以引起Bcl-2、Cyclin D1蛋白水平的降低,提示ZJQ-24可能是通过蛋白水平影响调控基因而非转录水平,可能具有抑制翻译的功能。5μM ZJQ-24导致HepG2细胞中p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)和翻译相关蛋白p-4E-BP1(Thr70)、p-eIF4E(Ser209)、p-eIF4G(Ser1108)表达水平的降低,进一步证明ZJQ-24对蛋白翻译有抑制作用。此外,由于4E-BP1、eIF4G竞争性与eIF4E结合,通过免疫共沉淀实验检测 ZJQ-24(1μM、5μM、10μM;24h)对 HepG2 中 4E-BP1、eIF4G 与 eIF4E 相互作用,发现eIF4G和4E-BP1的蛋白水平随ZJQ-24浓度的增加而降低,提示ZJQ-24通过影响eIF4G和4E-BP1与eIF4E的结合,抑制肿瘤细胞的增殖。综上所述,ZJQ-24在HepG2细胞中具有抑制增殖、促进细胞凋亡的作用,使HepG2在G2/M期发生阻滞并伴随早期凋亡,并显著抑制HepG2细胞的PI3K/Akt/mTOR通路,其作用位点可能是mTOR或者是下游eIF4E复合体。AhR(Arylhydrocarbon receptor,AhR),即芳香烃受体,在胃癌中高表达且与胃癌的发生密切相关。已有研究表明苯并噻唑类化合物5F-203在部分乳腺癌和卵巢癌等肿瘤细胞中,可作为AhR配体与之结合,从而诱导DNA损伤,导致细胞死亡。但5F-203在胃癌中的研究较少,因此,以胃癌为研究对象,深究5F-203的抗肿瘤作用及其作用机理。Tracey D.Bradshaw等人研究发现5F203在乳腺癌细胞MCF-7和卵巢癌细胞IGROV-1中的细胞毒性依赖于AhR,并通过诱导CYP1A1表达、激活药物代谢活性、导致DNA单/双链断裂,发挥抑癌作用。CYP家族(CYP1A1、CYP1B1、CYP2S1、CYP2W1)参与肿瘤细胞的代谢,AhR配体可以诱导CYP1A1、CYP1B1、CYP2S1的表达,导致DNA损伤,进而肿瘤细胞死亡。但CYP2W1在肿瘤中的表达量高于正常组织,AhR配体发挥抑癌作用时,CYP2W1的表达被抑制抑制作用。本课题前期检测了 5F-203对胃癌细胞的细胞毒性,发现5F-203在胃癌细胞SGC-7901、BGC-7901、KATOIII 的 IC50 值大于 50μM,胃癌细胞 NCI-N87 和 MKN-45的IC50值分别是22.63±4.28μM、0.090±0.0076μM。因此,选用MKN-45细胞作为研究对象。为了检测 AhR、CYP1A1 在 MKN-45、MCF-7、SGC-7901、HepG2、结肠癌细胞HCT116、前列腺癌细胞PC-3胞浆和核内的蛋白表达情况。Western Blot结果显示,胞浆和核内AhR在MKN-45中高表达,但它在MCF-7细胞中表达水平相对较低。接下来,检测5F-203对MKN-45细胞中AhR、CYP1A1蛋白和mRNA水平的变化。1μM 5F-203 处理 MKN-45 细胞发现,在时间梯度(1h、3h、6h;2h、6h、24h;24h、48h、72h)下,胞浆和核内的AhR蛋白表达水平降低,而CYP1A1表达水平增加,说明5F-203可以激活CYP1A1。随后,采用Real time-PCR实验检测5F-203对MKN-45细胞中CYP家族成员CYP1A1、CYP1B1、CYP2S1和CYP2W1转录水平的影响,发现CYP1A1、CYP1B1和CYP2S1的转录水平在3h、6h递增,12h时降低;而CYP2W1转录水平是先降低(3h、6h)后升高(12h)。从mRNA水平进一步证明了 5F-203对CYP家族具有激活作用。进一步研究5F203是否通过导致肿瘤细胞的DNA损伤而发挥抗肿瘤作用,5F-203(24h、48h、72h;1μM)处理的MKN-45细胞p-H2A.X增加,且具有时间依赖性,说明5F-203能够导致MKN-45细胞DNA损伤。为了解5F-203对MKN-45细胞增殖和凋亡的影响,检测细胞周期发现,1μM 5F-203在48h明显引起MKN-45细胞的G2/M期阻滞。同时,1μM 5F-203(1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h)处理MKN-45细胞,48h出现凋亡标志性蛋白PARP的切割,提示5F-203能够促进MKN-45细胞的凋亡。综上所述,5F-203对胃癌细胞MNK-45有明显的杀伤作用,初步推测5F-203是通过诱导MKN-45细胞AhR、CYP1A1蛋白的表达以及CYP1A1、CYP1B1、CYP2S1和CYP2W1的mRNA水平,抑制MKN-45生长,引起MKN-45细胞的G2/M期阻滞、发生细胞凋亡。