目的:重症肌无力(Myasthenia Gravis,MG)是一种神经-肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)传递功能障碍的自身免疫性疾病,病变主要累及NMJ突触后膜上的乙酰胆碱受体(acytylcholine receptor,AChR)。本病病变可累及眼肌、骨骼肌、吞咽肌、呼吸肌等多个肌群。目前治疗主要包括胆碱酯酶抑制剂、免疫调节、胸腺切除、注射免疫球蛋白、血浆置换等,但仍缺乏可独立用于MG治疗的理想手段。这说明MG可能存在免疫机制以外的发病机制。以往研究主要集中在抑制免疫反应和神经肌肉接头,而对需要线粒体供能才能收缩的肌细胞损伤病理机制研究较少。本研究包括临床回顾分析和动物实验研究。临床研究回顾了重症肌无力发病一般情况、常见诱因、合并胸腺瘤情况及重症肌无力危象发生与胸腺瘤的相关性,为临床治疗提供参考。动物实验研究通过复制实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)大鼠模型,通过检测大鼠骨骼肌线粒体呼吸链复合体I～Ⅳ酶活性改变,从能量代谢角度,探讨重症肌无力的发病机制,及健脾益气法改善EAMG大鼠骨骼肌线粒体能量代谢的可能机制;通过检测大鼠骨骼肌线粒体融合相关基因线粒体融合蛋白 1/2(mitofusion 1,Mfn1;mitofusion 2,Mfn2)、视神经萎缩蛋白 1(optic atrophy type 1,Opa1)以及分裂相关基因动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、线粒体分裂蛋白1(fission 1,Fis1)的mRNA和蛋白表达,同时观察强肌健力方对其影响,从线粒体融合分裂角度对重症肌无力的发病机制进行探讨,并进一步明确健脾益气法在改善EAMG大鼠骨骼肌线粒体形态结构和功能的可能机制,为健脾益气法治疗重症肌无力提供实验依据。方法:1临床回顾性研究通过查阅2013年8月至2016年12月广州中医药大学第一附属医院脾胃病科住院患者的电子病历,收集符合诊断标准、纳入标准及排除标准的重症肌无力患者,记录年龄及性别等一般资料、临床分型、发病诱因、合并胸腺瘤情况,按患者首次住院时的症状体征及舌脉情况对其进行辨证分型,主要分为脾胃气虚、脾虚湿热、脾肾1亏虚三型。探讨患者发病诱因及复发加重因素,中医证型、西医分型与胸腺瘤的相关性以及胸腺瘤与重症肌无力危象发生的关系。2动物实验研究2.1造模:实验选用SPF级6周龄雌性Lewis大鼠72只,随机选取10只大鼠作为正常对照组正常饲养,余62只采取皮下多点注射人工合成鼠源性乙酰胆碱α亚基97～116肽段制作EAMG大鼠模型,第6周末造模结束,模型组因造模及肌无力症状过重导致死亡8只,剩余54只,经肌电图检测,确定成模43只。2.2中药干预:采用随机数字表法随机抽取8只正常组大鼠及32只模型组大鼠,将模型组大鼠分为模型组、强肌健力方高剂量组(23.4 g/kg·d)、中剂量组(15.6 g/kg·d)、低剂量组(7.8 g/kg·d),每组各8只。分组后予中药灌胃治疗,正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃,治疗组分别依照规定剂量强肌健力方灌胃。以上各组灌胃液体量为1mL/100g体重,其浓度及等效剂量按体重折算,每日给药一次,共给药4周。2.3实验指标检测:实验结束后记录大鼠一般情况、体重及Lennon评分。五组大鼠经灌胃4周后,禁食12h,处死大鼠,剪取大鼠新鲜腓肠肌组织(-80℃C保存)待检。另取大鼠新鲜腓肠肌组织,提取骨骼肌线粒体,并按照相应试剂盒产品说明书进行线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性测定,比较各组之间的差异;采用PCR法检测大鼠骨骼肌融合分裂相关基因mfn1、mfn2、Opa1、Drp1及Fis1的mRNA表达变化,比较各组之间的差异;Western Blot法检测大鼠骨骼肌融合分裂相关基因mfn1、mfn2、Opa1、Drp1及Fis1的蛋白表达变化,比较各组之间的差异。结果:1临床研究1.1 一般资料:本研究共纳入患者262例,年龄最小者10岁,最大者85岁,平均年龄(45.66±16.48)岁,男:女=1:1.45。1.2 MG发病诱因及复发、加重因素:对MG患者发病诱因及复发、加重因素进行统计分析,发现首次发病时绝大多数无明显诱因(238例,占90.84%)。而复发、加重可由多种原因导致,其中肺部感染128例(占48.85%);其次为受凉、感冒29例(占11.07%);劳累13例(占4.96%);其它少见因素为减药和女性月经、生产等(占 3.82%)。1.3中医证型分布:在纳入患者的中医证型中脾胃气虚证所占比例最高,共141例(53.82%),脾肾亏虚证61例(23.28%),脾虚湿热证60例(22.90%)。1.4西医分型分布:在纳入的患者中,Osserman分型最多的为Ⅱb型患者,共150例(57.25%),其次是Ⅱa型,共44例(16.79%),之后依次为Ⅰ型29例(11.07%),Ⅳ 型 22 例(8.04%),Ⅲ 型 16 例(6.11%),V 型患者仅 1 例(0.38%)。1.5中医证型、西医分型与胸腺瘤相关性:在纳入的262例患者中,去除7例术后胸腺病理不详者,余下255例,合并胸腺瘤的患者共88例,占34.51%;合并胸腺增生26例,占10.20%。其中脾胃气虚证患者合并胸腺瘤共44例,脾虚湿热证22例,脾肾亏虚证22例,对不同中医证型患者合并胸腺瘤情况进行比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅰ型患者合并胸腺瘤共5例(16.67%),Ⅱa型患者合并胸腺瘤共13例(30.23%),Ⅱb型患者合并胸腺瘤共49例(34.03%),Ⅲ型患者11例(68.75%),Ⅳ型患者9例(40.91%)。不同分型合并胸腺瘤比较,Ⅲ型及Ⅳ型患者合并胸腺瘤比例明显高于另外三型患者,差异有统计学意义(P<0.05)。1.6胸腺瘤与重症肌无力危象发生的关系:在262例患者中,去除7例术后胸腺病理不详者,余下255例中,记录发生危象26例,占10.20%。发生危象的26例患者中,19例合并有胸腺瘤(73.08%);未发生危象229例患者中,69例合并胸腺瘤(30.13%)。发生危象与合并胸腺瘤比较,合并胸腺瘤患者危象发生率比例明显高于无胸腺瘤患者,差异有统计学意义(P<0.01)。2动物实验研究2.1一般指标观察:造模开始后,模型组大鼠逐渐出现毛色干枯无泽、色黄,体重显著下降(P<0.05)。经中药干预治疗后,大鼠皮毛色泽改善,体重较模型组上升,但仍小于正常组(P<0.05);高剂量组与中剂量组比较,体重无差异(P>0.05);中剂量组与低剂量组比较,体重有显著差异(P<0.05)。2.2骨骼肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性检测结果.:与正常组比较,模型组骨骼肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性均下降(P<0.01),差异具有统计学意义;经强肌健力方高、中剂量干预治疗后,复合体Ⅰ～Ⅳ酶的活性均有升高,其中复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ酶活性升高显著(P<0.01),而复合体Ⅲ酶活性,仅高剂量组差异有统计学意义(P<0.05);而低剂量组与模型组比较,复合体Ⅰ～Ⅳ酶的活性略有下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。2.3大鼠骨骼肌mfn1/2、Opa1、Drp1、Fis1 mRNA表达结果:模型组大鼠骨骼肌mfn1、mfn2、Opa1、Drp1、Fis1 mRNA表达较正常组大鼠显著降低(P<0.05)。中药干预后,强肌健力方高、中、低剂量组大鼠骨骼肌mfn1、mfn2、Opa1、Drp1及Fis1 mRNA表达较模型组均有升高,其中高剂量干预后mfn1、mfn2、Opa1、Drp1、Fis1与模型组比较均明显升高,差异具有显著性(P<0.05);而经中、低剂量组干预后,mfn1、mfn2、Opa1、Drp1、Fis1与模型组比较有升高趋势,但差异并无显著性(P>0.05)。2.4大鼠骨骼肌mfn1/2、Opa1、Drp1、Fis1蛋白表达结果:与正常组比较,模型组mfn1、mfn2、Opa1、Drp1、Fis1蛋白表达明显降低,差异具有非常显著性(P<0.01)。中药干预后,强肌健力方高、中、低剂量组大鼠骨骼肌mfn1、mfn2、Opa1、Drp1及Fis1蛋白表达均升高。其中mfn1、mfn2、Opa1、Drp1、Fis1高剂量组与模型组相比均有显著性差异(P<0.05或P<0.01);mfn1、Opa1、Drp1、Fis1中剂量组与模型组相比均有非常显著性差异(P<0.01),而mfn2中剂量与模型组比较表达升高,但差异无显著性(P>0.05);mfn1、mfn2、Drp1低剂量组与模型组相比均有非常显著性差异(P<0.01),而Opa1、Fis1低剂量与模型组比较表达升高,但差异无显著性(P>0.05)。结论:1临床研究1.1重症肌无力发病以女性患者为多见,可因感染、劳累、减药等诱因导致复发或病情加重,其中肺部感染最为常见。临床以中度全身型(Ⅱb型)患者最为多见。常见中医证型为脾胃气虚、脾虚湿热及脾肾亏虚证,说明脾胃虚损是本病主要病机。1.2通过对不同分型患者合并胸腺瘤情况进行比较,Ⅲ型及Ⅳ型患者合并胸腺瘤比例明显高于另外两型患者,差异有统计学意义,说明胸腺瘤与MG的严重程度存在明显相关性。对临床常见的三个中医证型进行了统计学分析,发现证型与合并胸腺瘤与否,无明显相关性。1.3通过重症肌无力危象与合并胸腺瘤比较,合并胸腺瘤患者危象发生率比例明显高于无胸腺瘤患者,说明胸腺瘤与MG危象的发生存在显著相关性。2动物实验研究2.1皮下多点注射鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段可成功复制EAMG大鼠模型。2.2强肌健力方可改善EAMG模型大鼠的肌无力症状、皮毛色泽并增加大鼠体重。2.3 EAMG大鼠骨骼肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性较正常组下降,可见EAMG大鼠存在呼吸链复合体酶活性减低,经强肌健力方干预治疗后活性明显升高,说明强肌健力可以提高复合体酶活性,使呼吸链功能恢复,从而改善EAMG大鼠骨骼肌能量代谢。2.4 EAMG大鼠骨骼肌mfn1、mfn2、Opa1、Drp1及Fis1的mRNA和蛋白表达明显降低,经强肌健力方干预后表达升高,说明线粒体融合分裂可能在重症肌无力的发病中起着一定作用,强肌健力方有可能通过提高线粒体融合分裂基因表达发挥治疗作用。