论文部分内容阅读
目的:1.观察不同时间香烟烟雾对大鼠肺及骨骼肌的影响。2.探讨中药复方"健脾益肺Ⅱ号"对香烟烟雾诱导的COPD大鼠骨骼肌萎缩的作用。以及中药复方"健脾益肺Ⅱ号(JY-Ⅱ)"通过干预AMPK/ULK-1信号通路改善COPD大鼠骨骼肌萎缩的机制。3.通过体外实验,初步探讨"健脾益肺Ⅱ号"改善骨骼肌萎缩的分子作用机制。方法:1.96只SD大鼠,采用随机对照实验方法,将大鼠按体重大小排列后,根据照随机数字表法分为6组,每组16只。分别为1个月正常组(Con-1m)、1个月模型组(CS-1m)、3个月正常组(Con-3m)、3个月模型组(CS-3m)、6个月正常组(Con-6m)、6个月模型组(CS-6m)。通过不同时间香烟烟雾刺激建立COPD大鼠模型。通过观察大鼠一般情况、体重及饮水量变化、肺功能及肺组织病理变化、支气管灌洗液中蛋白含量及超氧化物歧化酶含量、血常规变化及骨骼肌组织病理及其超微结构改变评估模型建立的情况。通过检测大鼠骨骼肌自噬相关蛋白和基因表达水平观察香烟对大鼠骨骼肌的影响。2.将45只SD大鼠,按照随机数字表法分为3组,每组15只。分别为正常组(Con组)、模型组(CS组)以及健脾益肺-Ⅱ号中药组(JY-Ⅱ组)。除Con组外,CS组与JY-Ⅱ组采用香烟烟雾刺激建立COPD大鼠模型。6个月后,观察JY-Ⅱ对香烟烟雾刺激后大鼠一般情况、体重、饮水量、肺功能、肺组织病理、支气管灌洗液中蛋白和氧化应激指标、血常规变化及骨骼肌自噬相关蛋白和基因的表达情况的影响。3.体外实验选用大鼠成肌细胞(L6细胞系),分别用香烟烟雾提取物(CSE)和JY-Ⅱ复方干预L6细胞,观察CSE诱导的L6细胞自噬相关蛋白Lc3B、Beclin-1、AMPKα、p-AMPKα、ULK等表达的影响以及JY-Ⅱ干预后上述蛋白的变化。并应用AMPK激动剂(AICAR)和抑制剂(BML275)作用于细胞,观察其对上述蛋白的变化。结果:1.随着香烟烟雾刺激时间增加,CS组大鼠精神状态逐渐变差,皮毛逐渐变黄色,干枯粗糙。饮食逐渐减少。接受香烟烟雾刺激时聚集成堆,蜷缩少动。CS组大鼠体重增长慢于Con组(P<0.05),随熏烟时间越长,体重差异一直存在(P<0.05)。香烟烟雾刺激后,CS组大鼠饮水增多,与Con组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。CS组大鼠肺总量高于Con组大鼠(P<0.05)。且随着香烟烟雾刺激天数的增加肺总量越高。在香烟烟雾刺激后第1个月和第3个月,CS组大鼠肺气道阻力(RI)高于Con组(P<0.05)。香烟烟雾刺激后第3个月,CS组大鼠FEV0.1/FVC降低,与Con组大鼠比较,差异有统计学意义(P<0.05)。光镜下CS组大鼠肺组织结构逐渐改变,肺泡壁断裂,融合形成肺大泡,肺泡间隔及肺泡壁增厚。从第3个月开始,CS组大鼠肺泡空白面积较Con组增多(P<0.05)。香烟烟雾刺激3个月后,Con组大鼠腓肠肌肌肉组织结构正常,CS组肌纤维散在分布,肌纤维面积较正常组减少(P<0.05)。随香烟烟雾刺激时间增加,CS组大鼠肌肉纤维面积逐渐缩小(P<0.05)。在香烟烟雾刺激3个月后,电镜下CS组肌纤维排列较整齐,嵴部皱褶少。高倍镜下可见少量空泡样病变。随香烟烟雾刺激时间增加,空泡样变逐渐增多。3个月时,CS组大鼠血液中白细胞(WBC)总数、单核细胞(MONO)总数、红细胞(RBC)总数以及血红蛋白(HGB)含量高于Con组,差异有统计学意义(P<0.05);6个月时CS组红细胞数量(RBC)以及血红蛋白数量(HGB)高于Con组,差异有统计学意义(P<0.05)。香烟烟雾刺激后,CS组大鼠支气管灌洗液(BALF)蛋白高于Con组大鼠(P<0.05)。而CS组SOD含量仅在熏烟第1个月与Con组差异有统计学意义(P<0.05),血清LDH仅在熏烟第6个月与Con组差异有统计学意义(P<0.05)。香烟烟雾刺激后,CS组大鼠骨骼肌自噬相关蛋白Beclin-1与LC3B(尤其是LC3B-Ⅱ)、p-AMPK与ULK-1含量升高(P<0.05)。香烟烟雾刺激后,CS组大鼠腓肠肌Lc3B mRNA的相对表达高于Con组(P<0.05)。2.熏烟6个月之后,JY-Ⅱ组大鼠体重高于CS组(P<0.05),差异有统计学意义。JY-Ⅱ组大鼠且肺泡空白面积较CS组降低(P<0.05)。JY-Ⅱ组大鼠腓肠肌肌肉纤维面积较CS组缩小缓慢,散在聚集的数量也减少(P<0.05)。电镜超微结构显示JY-Ⅱ组大鼠低倍镜下肌纤维排列较整齐,Z线清楚,嵴部皱褶消失。高倍镜下空泡样变少于CS组。JY-Ⅱ组大鼠血液RBC与HGB以及血清LDH含量较CS组降低(P<0.05)。JY-Ⅱ大鼠腓肠肌自噬蛋白Lc3B及Lc3B mRNA的相对表达量较CS组大鼠降低(P<0.05)。3.大鼠成肌细胞(L6细胞系)经过不同浓度的香烟烟雾提取物(CSE)干预24h、48h和72h后,呈现出不同的趋势。其中10%CSE在24h对L6细胞有抑制作用(P<0.05)。L6细胞经过不同浓度的JY-Ⅱ中药复方24h、48h和72h的干预后,呈现出不同的趋势。其中在6-10mg/ml的JY-Ⅱ中药液对L6细胞有抑制作用;且随着时间的增加,抑制率也不断增加,呈时间和剂量的依赖性。1-4mg/ml对L6细胞有增殖作用。不同浓度CSE均可以提高L6细胞Lc3B蛋白尤其是Lc3B-Ⅱ表达(P<0.05)。在CSE诱导L6细胞后,自噬相关蛋白Beclin-1、p-AMPK以及其下游蛋白(ULK-1)相对含量高于Con组,差异有统计学意义(P<0.05)。JY-Ⅱ组p-AMPK及ULK-1蛋白较CS组明显降低。结论:1.香烟烟雾能够引起SD大鼠COPD肺部及骨骼肌病理改变。2.COPD大鼠存在骨骼肌萎缩,与香烟烟雾激活大鼠自噬蛋白上调有关。3.CSE对L6细胞的增殖作用有抑制性,且呈浓度依赖关系,浓度越高,抑制性越强。4.CSE能够激活并上调L6细胞自噬蛋白的表达。5.JY-Ⅱ能够改善COPD大鼠骨骼肌萎缩,可能是通过下调AMPK/ULK信号通路,并一定程度上抑制Lc3B表达实现的。