前言随着社会健康产业的发展,蛋白质粉作为一种新兴的保健品逐渐走进了超市、药店和消费者家庭。蛋白质粉服用方便,是低脂肪、低胆固醇的优质蛋白质,长期服用,不会引起肥胖、高血脂、心脑血管病等富贵病。目前市场上的多数蛋白质粉产品由大豆蛋白和乳清蛋白配比而成。因此,本项目拟以主要成分为大豆蛋白和乳清蛋白的复合蛋白质粉为研究对象,测定其成分并分析其可能具有的功效；进行幼年大鼠生长实验以评价其蛋白质质量；对老年大鼠进行蛋白质粉干预,测定免疫和抗氧化指标并分析其对老年大鼠衰老的影响,通过综合性研究复合蛋白质粉的营养价值及对老年大鼠抗衰老的影响,为相关保健食品的功效提供实验依据。第一章蛋白质粉的营养价值评价(一)蛋白质粉的成分分析研究目的对受试蛋白质粉进行营养成分分析和功效成分分析,包括粗蛋白、粗脂肪、碳水化合物、粗纤维等主要营养素含量、9种常量元素和微量元素、3种脂溶性维生素、3种水溶性族维生素以及18种氨基酸、磷脂的含量,生物活性成分主要包括大豆异黄酮、总皂甙等植物化学物,分析其成分特点,为后续研究其营养生理功能奠定基础。方法根据国标方法或国际公认方法对蛋白质粉进行营养成分检测,将检测数据与《中国食物成分表2002》中列出的常见富含优质蛋白的食物(如肉、蛋、奶等)成分数据进行比较,以综合评定受试蛋白质粉的营养价值。检测项目包括蛋白质、氨基酸、粗脂肪、脂肪酸、磷脂、碳水化合物、粗纤维、维生素A、D、E、叶酸、胆碱、生物素、钙、镁、钾、钠、铁、铜、锌、硒、锰、总皂甙和大豆异黄酮。结果1.蛋白质粉的蛋白质含量接近80.0%。其中必需氨基酸(Essential amino acids, EAA)含量较高,占被测氨基酸总量的41.62%。支链氨基酸(Branched chain amino acids, BCAA)含量约占蛋白质含量的20%。BCAA与芳香族氨基酸(Aromatic amino acid, AAA)比值为2.05。受试蛋白质粉的氨基酸评分(Amino acid score, AAS)、化学评分(Chemical score, CS)为86.3、59.6。2.蛋白质粉的总脂肪含量为3.32%,其中,必需脂肪酸(亚油酸)含量为45.69%,不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例约为2：1(1.93：1),三种脂肪酸的比例PUFA:MUFA:SFA=1.36:0.59:1.磷脂含量为2.7%,提示受试蛋白质粉具有一定量的磷脂。蛋白质粉的碳水化合物含量检测结果为1.02g/100g。粗纤维含量测定结果为<0.5g/100g。采用计算法获得蛋白质粉的热量为：1480KJ/100g(或354Kcal/100g)。3.蛋白质粉的维生素A的含量为12.3μg/100g,维生素D的含量<1μg/100g,维生素E的含量为1.28mg/100g,胆碱的含量为203mg/100g,生物素的含量<2.0μg/100g,叶酸的含量为359μg/100g。常量元素钙、镁、钾、钠的含量分别为161、59.7、413、370(mg/100g),微量元素铁、铜、锌、硒、锰的含量分别为9.18mg/100g、0.945mg/100g、2.5mg/100g、0.936mg/100g、10.0μ/100g。总皂甙含量为0.98g/100g,大豆异黄酮总量为37.56mg/100g。结论受试蛋白质粉的蛋白质含量高,氨基酸组成模式合理,与FAO/WHO模式相近,且EAA、BCAA含量较高,氨基酸评分和化学评分高于大豆分离蛋白等。受试蛋白质粉的脂肪含量低,含有一定量的磷脂。受试蛋白质粉还含有胆碱、叶酸、铁、锌、硒等微量营养素,以及总皂甙和大豆异黄酮等生物活性成分,提示受试蛋白质粉由乳清蛋白和大豆分离蛋白科学配比而成,并在加工过程中保持了尽量多的功效成分。(二)蛋白质粉的营养价值评价目的通过动物实验来进行蛋白质粉的蛋白质质量评估,包括蛋白质功效比值(Protein efficiency radio, PER)实验和氮代谢实验。生长率测定方法中,PER实验的使用最为广泛,该法已普遍用于预测人类所需的蛋白质质量,1990年被美国FDA作为营养标签和教育法案(Nutritional Labeling and Education Act, NLEA)中判定蛋白质质量所用的方法。至于氮平衡的评价,常用的有指标有消化率(Digestibility)、生物价(Biological value, BV)和蛋白质净利用率(Net protein utilization, NPU)。根据大鼠生长状况和这些常用指标来评价蛋白质粉并与其它优质蛋白比较,可得出比较全面的蛋白质评价结果。方法1.PER测定。参照AOAC方法中蛋白质功效比值(PER)测定方法的饲料配方要求配制实验动物饲料并测定其蛋白质含量。购买初断乳的SPF级雄性Wistar大鼠36只,体重40g左右。大鼠按体重顺序,以随机区组法分为3组,每组12只。各组动物平均体重组间差不大于5g,组内体重差不大于10g。大鼠经过3d的适应环境阶段后进入实验期。实验期不同组分别喂不同配方的饲料,并进行相关指标检测和观察。动物单笼饲养,自由进食和饮水,每3d和每周末测量记录1次体重和身长,每日记录进食量,实验期为28d。2.消化率测定。使用180g左右的幼年Wistar大鼠12只,将每只大鼠分别移入单独的代谢笼,适应环境以后,按重量分为2组,每组6只大鼠,每组大鼠体重平均值差别不大于5g。给实验组喂测试饲料的同时给对照组喂无氮饲料。提供充足的水,但食物严格限制为15g/d。喂食实验饲料9d,收集后5d的溢出食物、粪、尿,使用凯氏定氮法测定粪氮和尿氮。根据公式计算出PER、校正PER、AD、 TD、BV和NPU。结果大鼠的生长实验显示蛋白质粉组和酪蛋白组的食物利用率无显著性差异(P=0.365),受试蛋白质粉的蛋白质功效比值(PER)为2.22±0.08,表观消化率(AD)和真消化率(TD)分别达到了99.45%和99.46%,生物价(BV)为93.14,蛋白质净利用率(NPU)为92.60%,与酪蛋白接近。结论动物实验结果表明,大鼠对受试蛋白质粉的消化吸收好,受试蛋白质粉可明显促进动物的生长发育和维持氮代谢平衡。受试蛋白质粉的PER与酪蛋白接近,蛋白质的表观消化率和真消化率、生物价、蛋白质净利用率等评价指标均较高,说明受试蛋白质粉提供的蛋白质营养价值高。第二章蛋白质粉对老龄大鼠抗衰老作用的实验研究目的已有的文献报道及本课题的前期研究均提示,受试蛋白质粉的氨基酸组成特点及含有的功效成分有助于抗氧化及改善机体免疫功能。目前有关蛋白质粉补充对老年人营养状况、抗氧化作用的影响及改善免疫功能的报道不多,随着我国社会老龄化步伐的加快,有必要加大对补充蛋白质类及抗氧化、抗衰老保健品的研究。本研究观察蛋白质粉补充对老年大鼠营养生化指标和抗氧化功能的影响、对老年大鼠免疫功能的影响,为蛋白粉类保健食品的开发提供理论依据。方法12月龄雌性SD大鼠40只,根据体重随机分成对照组和蛋白质粉低、中、高剂量组4组。对照组大鼠灌胃蒸馏水,3组实验组分别灌胃不同剂量(0.167g/kg.bw、0.833g/kg.bw、1.667g/kg.bw)的蛋白质粉混悬液,每天一次。动物自由饮用蒸馏水,每日定时记录进食量,保持进食量(大鼠常规基础饲料)一致。实验结束时,心脏采血检测血清的生化指标和抗氧化、免疫指标,包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)、免疫球蛋白A(Immunoglobulin A, IgA)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG)、免疫球蛋白M (Immunoglobulin M, IgM)、T细胞亚群CD3、CD4、CD8和白细胞介素2(Interleukin-2, IL-2)等；取脑、肝、肾、脾脏、胸腺等称重并检测总蛋白含量,检测脑脂褐质(Lipofuscin, LF)含量及脑单胺氧化酶(Monoamine oxidase, MAO)活性,并检测肝脏主要脂类水平和脂酶活性等。结果1.实验组大鼠血清总蛋白、总铁结合力显著高于对照组,高剂量组大鼠血清总胆固醇显著低于对照组。实验组老龄大鼠肝脏总胆固醇(Total cholesterol, TC)含量显著低于对照组(F=4.977,P=0.006),实验组大鼠肝脏甘油三酯(Triglyceride, TG)含量低于对照组,但差异无统计学意义。补充蛋白质粉对老龄大鼠体重无显著影响,但实验组大鼠脑、肝脏、肾脏总蛋白浓度较对照组高。中、高剂量组大鼠血清LDH活性高于对照组,但差异无统计学意义,蛋白质粉补充对老年大鼠血清碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草转酶(Aspartate aminotransferase, AST)活性影响不大。研究结果提示,受试蛋白质粉可提高老龄大鼠血清和组织中的总蛋白含量,并对老年大鼠肝脏脂质代谢有积极意义。2.蛋白质粉补充能提高老龄大鼠血清中SOD活性,降低MDA含量。蛋白质粉中、高剂量组大鼠血清SOD活性显著高于对照组(P=0.014,P=0.005),蛋白质粉低、中剂量组大鼠血清MDA含量显著低于对照组(P=0.024,P=0.024)。中剂量组大鼠脑MAO活性显著降低(P=0.037)。结果提示,适量补充蛋白质粉对老龄大鼠具有一定抗氧化作用、抗衰老作用。3.补充蛋白质粉对老年大鼠的免疫器官指数有一定影响,低、中剂量组大鼠脾脏指数显著高于对照组,差异有统计学意义(P=0.037,P=0.029),实验组大鼠胸腺指数均高于对照组,但差异没有统计学意义。蛋白质粉补充对老年大鼠体液免疫功能有一定影响,实验组大鼠血清IgM水平显著高于对照组(F=20.896,P=0.000),中、高剂量组血清IgM水平显著提高(P<0.05)。此外,实验组大鼠血清IgA、IgG水平均高于对照组,但差异无统计学意义。蛋白质粉补充对老年大鼠细胞免疫功能有一定改善,实验组大鼠血清T细胞亚群CD3、CD4、CD8水平显著增高(F=0.474,P=0.000；F=55.947,P=0.000; F=200.234,P=0.000),并随蛋白质粉补充剂量增加而增高,但CD4/CD8比值变化无显著性。此外,实验组大鼠血清中IL-2含量显著增高(F=74.531,P=0.000)。研究结果提示,蛋白质粉补充有助于改善老龄大鼠的免疫功能。结论补充受试蛋白质粉可提高老龄大鼠血清和组织中的总蛋白含量,改善老年机体的营养状况,并对老年大鼠肝脏脂质代谢有积极意义。受试蛋白质粉对老龄大鼠具有一定抗氧化作用,适量补充能提高老年大鼠血清中SOD活性,降低MDA含量和脑MAO活性。受试蛋白质粉对老龄大鼠的免疫功能具有改善作用。总之,适量补充受试蛋白质粉能够改善老龄大鼠营养状况,并具有改善免疫功能、抗氧化、抗衰老作用。