猪瘟是一种猪的高度接触性传染的病毒性疾病,严重威胁养猪业的发展,是我国猪的四大疫病之一。疫苗接种是控制猪瘟的重要手段,但采用弱毒疫苗对猪免疫后很难区分被免疫和自然感染的猪,影响了猪瘟防治。而DNA疫苗能够同时诱导机体产生体液和细胞免疫反应,因不存在活疫苗毒力反强的潜在危险,已广泛应用于抗猪瘟病毒疫苗的研究。为了建立猪瘟血清学快速诊断的方法,开发猪瘟新型疫苗,研究E2蛋白的功能,本文构建了CSFV E2原核表达重组质粒,成功制备了鼠抗猪瘟病毒E2蛋白的多抗和单抗,建立了筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法,同时也建立了鉴定单抗特性的方法,可望在猪瘟的预防与控制中发挥重要作用。首先,根据GenBank中登录的CSFV基因组序列及原核表达质粒pGEX-4T-1的多克隆位点,设计了一对针对E2蛋白A/D区域的原核表达引物,利用PCR技术从本实验室保存的重组质粒pGEX-4T-1-TE2中扩增出大小为290bp的基因E(A),为了获得E(A)蛋白作为制备单抗的抗原,我们应用DNA重组技术,将E(A)基因亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌Rosetta。经菌液PCR、质粒PCR与双酶切鉴定后,筛选获得阳性克隆pGEX-4T-E(A)。然后经IPTG诱导对含有pGEX-4T-E(A)质粒的Rosetta菌进行了大量表达,获得了较高浓度的GST-E(A)包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-E(A)融合蛋白。融合蛋白的分子量约为35.0KD,与预期结果相符。Folin-酚法测定提取蛋白的浓度为2.14mg/ml,满足下一步实验的要求。其次,利用纯化的GST-E(A)融合蛋白免疫BABL/c小鼠,制备鼠抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体。取三次免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10:1进行融合,10~15天后初次检测。试验中共融合两次,两次融合率分别约为80%和70%,初检阳性率分别为10%和5%。经多次亚克隆反复筛选后,共获得两株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为C3和A1。杂交瘤细胞经过多次传代培养后,仍能分泌高效价的抗体。C3和A1的杂交瘤细胞上清和小鼠腹水ELISA效价分别为1:2000、1:2000和1:256000、1:128000左右。Western-blot和IFA分析表明,两株单抗均可以识别CSFV兔化弱毒疫苗株,同时也与GST-E(A)融合蛋白发生特异性的反应,说明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白上的一个保守线性表位。最后,为了研究CSFV E2蛋白抗原表位的性质,对单抗C3的抗原表位进行了初步筛选,应用DNAStar分析软件对E(A)基因的原表位进行分析,分段表达各抗原表位的融合蛋白GST-E(A1)和GST-E(A2),利用Western-blot分析,结果显示,单抗C3识别的抗原表位位于序列TAVSPTTLRT之间,该结果需利用噬菌体展示技术进一步证实。综上所述,本研究构建了E2原核表达的重组质粒,成功制备了两株针对CSFV E2蛋白的单克隆抗体,建立了单克隆抗体生物学特性鉴定及其相应抗原表位的筛选方法,这些研究将为CSFV新型疫苗研制和诊断试剂开发奠定基础,也为进一步研究CSFV E2蛋白的结构、功能、抗原表位建立一定的实验基础。