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Notch信号通路在多细胞生物的进化过程中高度保守,是介导细胞间直接接触的主要信号通路之一,在肿瘤细胞的分裂、分化、增殖、凋亡和控制血管新生等方面具有重要作用。Notch的异常调控会引起组织发育的异常,并导致肿瘤的发生;因此,Notch信号通路的调控将是一条潜在有效的抗肿瘤途径。目前已知的Notch通路抑制剂作用靶点主要包括Notch受体与配体、ADAM、γ-分泌酶、转录因子RBP-jk,其中针对Notch受体与配体主要是一些大分子单抗,其生产成本高、稳定性较差;由于γ-分泌酶、ADAM在其他信号通路中同时存在,作用于γ-分泌酶、ADAM的抑制剂的特异性较差。此外,针对经典Notch通路的关键转录因子RBP-jk,虽然开发出一些小分子抑制剂,具有较强的特异性,但候选分子数量较少且仍停留在实验室和临床前阶段。所以本研究以Notch通路关键转录因子RBP-jk为靶点,使用虚拟筛选技术从具有免疫抗肿瘤作用中药成分及上市药物中筛选潜在的RBP-jk抑制剂,并对筛选得到的候选化合物进行抗肿瘤作用机制的研究,包括:体外细胞和体内动物模型、分子机制的研究等。本论文主要分为以下四个部分:1.综述本章主要围绕Notch信号通路、基于计算的分子对接、分子动力学模拟进行综述,首先,介绍Notch信号通路的作用机制,以及Notch通路抑制剂的国内外研究进展;然后介绍了分子对接技术和分子动力学模拟技术,以及在药物设计和筛选方面的应用。本章综述的内容将为本研究提供理论、数据和方法学的支撑。2.基于分子对接与分子动力学模拟的RBP-jk抑制剂的筛选本章使用分子对接技术对具有免疫抗肿瘤作用的中药成分及上市药物进行筛选。首先通过分析NICD-MAML-RBP-jk-DNA复合物的相互作用模式和NICD、MAML、DNA与RBP-jk的对接结果,确定RBP-jk小分子抑制剂的活性位点,以及明确了38个关键氨基酸残基:Lys44、Tyr46、Lys50、Arg51、Phe52、Cys86、Phe88、Met98、Lys130、Gly134、Ser136、Asp138、Ser151、Ser154、Gln158、Arg178、Arg180、Ser181、Gln182、Phe221、Val223、Met243、Pro246、Lys271、Gln293、Gln347、Leu348、Gly350、Glu358、Asn367、Arg369、Arg378、Tyr381、Arg382、Cys383、Gly384、Glu385、Asn417,并将这些相互作用的模式作为对接结果的分析依据。通过全原子对接方式,按照以下标准筛选小分子抑制剂:小分子化合物与RBP-jk的对接结合能<-7.5 kcal/mol、化合物填充活性口袋的能力;最终筛选得到21个小分子化合物。随后基于活性口袋中的38个关键氨基酸残基,通过限制结合位点的方式对候选化合物进行进一步的对接筛选。以化合物与RBP-jk的对接结合能<-8 kcal/mol、化合物与RBP-jk活性口袋中关键残基发生相互作用≧3、化合物结合在活性口袋并与活性口袋的构象互相匹配为筛选原则,筛选得到小分子化合物非达霉素、夏佛塔苷和阿卡波糖。随后,对三个候选化合物与RBP-jk的结合能力进行考察,分子对接结果表明非达霉素、夏佛塔苷、阿卡波糖可以稳定结合在活性口袋的分子个数分别为3、4、3个,从而将结合口袋完全占据,具有潜在的抑制活性。此外,以候选化合物与RBP-jk形成的复合体为受体,验证化合物阻断RBP-jk与DNA结合的能力,分子对接结果表明候选化合物与RBP-jk结合后,能够有效阻碍DNA与RBP-jk的结合,并且DNA的结合位点明显偏离原本的活性作用位点,进一步验证了候选化合物的抑制能力。最后,通过分子动力学模拟对筛选得到的候选化合物进行进一步考察,结果表明非达霉素、夏佛塔苷和阿卡波糖与蛋白质的结合能分别为-154.142±12.316k J/mol、-167.584±15.725k J/mol、-163.674±8.845k J/mol,候选化合物与蛋白质分子具有较强的结合,可作为潜在的Notch通路抑制剂进行后续研究。因此,最终筛选得到非达霉素、夏佛塔苷、阿卡波糖作为Notch通路小分子抑制剂候选化合物。3.RBP-jk抑制剂的体外抗肿瘤活性研究本章利用人源乳腺癌细胞系MCF-7和鼠源乳腺癌细胞系4T1,分别考察非达霉素、夏佛塔苷、阿卡波糖的体外抗肿瘤活性。实验结果表明非达霉素对MCF-7细胞和4T1细胞的IC50值分别为53.4μM和32.3μM,具有一定的抗肿瘤效果,以及具有剂量依赖性。但夏佛塔苷、阿卡波糖在1-400μM浓度范围内未见明显抗肿瘤效果,可能是由于两种化合物不能进入细胞核发挥作用。随后考察筛选得到的化合物非达霉素的入细胞核机制,利用激光共聚焦扫描显微技术发现非达霉素在给药0.5h后已有部分进入细胞核,随着药物作用时间延长,入核的药物量也随之增加,验证了非达霉素能够入核进行作用。并且在非达霉素分别给药24h、48h后,利用q RT-PCR技术检测Notch通路中Notch1、HES1、HES5、HEY1的基因水平,实验结果表明药物分别作用24h、48h后,Notch1、HES1、HES5、HEY1等多个基因的表达水平都显著下调,证明非达霉素可以抑制Notch通路中相关基因的表达。最后,利用Western Blotting法检测药物作用24h和48h后Notch通路下游蛋白HES1、HES5的表达水平。实验结果表明非达霉素作用24h后,HES1、HES5的蛋白表达量未见明显变化;但在作用48h后,HES1、HES5的蛋白表达量均显著下调。这些实验结果揭示了非达霉素的作用机制,表明其能够通过抑制Notch通路诱导细胞凋亡。4.Notch通路小分子抑制剂的体内抗肿瘤活性研究利用4T1荷瘤小鼠模型,分别考察了非达霉素高剂量（50 mg/kg）、中剂量（25 mg/kg）、低剂量（5 mg/kg）组的体内抗肿瘤活性。结果显示非达霉素的低、中、高剂量组的肿瘤抑制率分别达到31.77%、56.56%、83.19%,表明非达霉素的体内抗肿瘤活性具有剂量依赖性;并且作为FDA批准上市的药物,对小鼠体重影响小,安全性高。以上数据证明了非达霉素具有显著的体内抗肿瘤活性和较高的体内安全性。进一步研究其作用机制,利用Western blotting法检测肿瘤组织中Notch下游分子HES1、HES5的蛋白水平;结果显示与模型组相比,非达霉素药物组能够显著下调Notch通路下游蛋白HES1、HES5的表达量。并且随着药物浓度的增高,HES1、HES5蛋白的表达量越低,验证了非达霉素能够作为Notch通路抑制剂,从而实现抑制肿瘤生长的作用。综上所述,本研究通过虚拟筛选、体内外抗肿瘤活性考察、基因和蛋白表达水平的检测,成功筛选到Notch通路小分子抑制剂非达霉素,并且通过体内外实验确认了非达霉素具有明显的抗肿瘤作用和Notch通路抑制的作用机制。本研究的成果丰富了Notch通路抑制剂结构的多样性,并为以后基于计算筛选Notch通路抑制剂提供了方法借鉴。