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目的:
阿片类药物滥用已经成为全球性的公害；近几十年来,全世界吸毒人数持续增加,而女性吸毒人数近年呈上升趋势,她们多为或将要进入育龄期的妇女。母亲吸毒,尤其在孕期吸毒,可对胎儿及新生儿产生严重影响。阿片类药物可以通过作用于胎盘而影响胎儿的生长发育,但未有研究发现其可直接影响蜕膜基质细胞的生长增殖。因此本课题在研究雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progesteronereceptor,PR)以及μ阿片受体(μ-opioidreceptor,MOR)存在于人蜕膜基质细胞(decidualstromalcell,DSC)的基础上,用吗啡干预体外培养的人早孕蜕膜基质细胞,观测基质细胞ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA表达的变化,通过探讨外源性阿片类药物对蜕膜基质细胞的直接作用,为进一步寻求减少或阻断吗啡依赖对孕妇及胎儿的负面影响提供一定的思路,从而探究阿片类药物对妊娠的影响。
材料及方法:
留取2009年11月到2010年1月山西医科大学第一临床医院妇产科人流室提供正常妊娠6—9周行人工流产的蜕膜组织8例,并征得患者的知情同意。孕妇健康无合并症。年龄20-30岁,B超证实为宫内妊娠。取得蜕膜组织,以无菌瓶收集,并立即送到实验室,用胰蛋白酶及EDTA消化并进行全组分蜕膜细胞培养,利用传3代的方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯。将培养出的基质细胞通过催乳素(prolactin,PRL)免疫组织化学染色,及逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)法进行鉴定；参考相关文献,将所培养的细胞分为6组,分别是对照组(空白对照)；吗啡极低剂量组(单纯加入吗啡,终浓度为10-7mol·L-1)；吗啡低剂量组(单纯加入吗啡,终浓度为10-6mol·L-1)；吗啡中剂量组(单纯加入吗啡,终浓度为10-5mol·L-1)；吗啡高剂量组(单纯加入吗啡,终浓度为10-4mol·L-1)；吗啡+纳洛酮组(提前加入纳洛酮孵育1h,再加入吗啡,二者的终浓度为10-5mol·L-1)。首先通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测各试验组在不同的时间内蜕膜基质细胞增殖情况,再采用RT—PCR法.利用样本与β—actin的灰度比值,计算出各试验组ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA的表达水平。
所有数据均以均数±标准差((x)±s)表示,采用SPSS16.0统计软件对MTT增殖试验结果进行5×3析因设计的方差分析,对RT—PCR结果进行单因素方差分析和LSD检验,比较量效关系时用对数线性相关分析；以α=0.05为检验水准。
结果:
(一)人蜕膜基质细胞悬浮时呈典型的卵圆形,接种24h后细胞大部分已贴壁,贴壁生长的细胞为纤维母细胞状。培养6-7天细胞贴壁汇合可进行传代培养,传代后的蜕膜细胞生长迅速,4—5天传代1次,倒置显微镜下可见细胞形态均一,呈较细长的梭形或不规则星形,核呈卵圆形,位于细胞中央,核仁清晰,有丰富的胞质颗粒。采用传3代的方法对蜕膜基质细胞进行分离提纯,经PRL免疫组化鉴定,90％以上的细胞胞浆被染成棕黄色至深棕色,胞核未见染色。RT-PCR法显示分离培养的细胞表达ERmRNA、PRmRNA。说明利用酶消化及传3代的方法可方便地从人蜕膜组织中获得大量、高纯度的人蜕膜基质细胞,并保持了其在体内的功能,可用于进一步的研究。
(二)结合MTT结果,吗啡的浓度和生长时间对基质细胞的增殖都有影响,在相同的时间点随着吗啡浓度的增加OD值减少(P<0.05),表明吗啡浓度越大对基质细胞增殖的抑制作用越强；在不同的时间点里基质细胞的增殖速度不同(P<0.05),尤其是在吗啡干预后的24h-48h增殖差异最显著(P<0.05),用药后24h-72h随时间增加,细胞计数增加。
(三)RT—PCR结果显示:ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA和内参β-actin的基因产物分别在249bp、196bp、342bp、307bp处出现特异性扩增条带。不同浓度吗啡组的ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA表达分别与对照组及吗啡+纳洛酮组之间比较均有统计学意义(P<0.001),且随着吗啡浓度的减少人蜕膜基质细胞内ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA表达增加,二者之间呈负相关(r=-0.991,P<0.001；r=-0.981,P<0.001；r=-0.992,P<0.001)。
结论:
人蜕膜基质细胞上存在μ-阿片受体；在细胞水平上,吗啡对人蜕膜基质细胞增殖有直接的抑制作用,而这种作用一定程度上可被特异性阿片受体拮抗剂纳洛酮抑制。在分子水平上,吗啡可直接使人蜕膜基质层细胞ERmRNA、PRmRNA、MORmRNA表达下降,且呈剂量依赖性下调。