研究背景:微生物群作为胃肠道黏膜环境的重要组成部分,不仅能造成DNA损伤,产生毒性代谢产物,还能促进肿瘤的发生。近年来,梭杆菌属作为消化道微生物群的重要组成部分,在消化道肿瘤发生发展中起到至关重要的作用。在食管癌中,梭杆菌属DNA水平与肿瘤浸润组织深度相关,在结肠癌中也可分离出梭杆菌的存在。一项对于台湾人群胃癌患者的研究中表明,梭杆菌属、梭菌属和乳杆菌属在胃癌患者胃黏膜分布丰富,梭菌属和梭杆菌属在胃癌样本中高度富集,且二者组合用于诊断胃癌有100%的敏感性和70%的特异性。具核梭杆菌作为梭杆菌是一个标志性的菌种,也参与胃肠道肿瘤的发生。具核梭杆菌是一种革兰氏阴性的专性厌氧菌,在食管癌和结直肠癌中,通过对具核梭杆菌DNA进行PCR扩增,均可检测到它的存在。在结直肠癌中,具核梭杆菌被认为是癌症发生的致病微生物,与细胞增殖、T细胞、炎性细胞因子表达、microRNA、CpG岛甲基化表型、微卫星不稳定性等密切相关。目前,在胃癌与具核梭杆菌的研究中,仅有小样本实验提出胃癌组织中有梭杆菌属和具核梭杆菌的存在,其感染的作用及分子机制尚未明确。本课题组前期通过16S rRNA测序技术对胃癌及其远端正常的癌旁组织菌群分布及特征进行分析,梭杆菌属在胃癌及癌旁组织中的分布存在差异:胃癌组织中梭杆菌属分布高于癌旁组织。近几年,梭杆菌属及具核梭杆菌感染与胃癌的相关研究仍处在起步阶段,多数研究集中探讨组织微生物学分布、多样性差异的变化,对梭杆菌属与胃癌表型的关系尚未明确,对具核梭杆菌对胃癌发生发展的作用及分子机制尚处未知。研究目的:探讨不同梭杆菌属感染状态胃癌的表型特征,阐明具核梭杆菌与胃癌风险、预后、增殖及代谢表型的关系及作用机制。研究方法:第一部分:不同梭杆菌属感染状态胃癌表型特征分析1、病例选择:中国医科大学附属第一医院肛肠外科2012年6月至2014年6月接受胃大部切除术的61例胃癌患者,经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,符合纳入排除标准并签署知情同意书。通过病历资料收集胃癌患者年龄、性别的基本信息及临床病理参数信息,包括TNM分期、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、Lauren分型、癌周淋巴细胞浸润、脉管瘤栓、淋巴结转移情况、幽门螺杆菌感染情况、免疫组化相关指标（p53、CEA、C-erb B、Ki67）的表达情况。手术后每半年对研究对象以电话形式进行随访,总体生存期及死亡日期随访截止至2019年11月13日。收集到的用于病理诊断的病灶部位的新鲜胃黏膜组织在术后立即冷冻并储存在-80℃冰箱中备用。2、16s rRNA测序相关微生物分析胃癌组织16s rRNA测序数据利用Qiime2平台降噪得到s OTU数据并与Greengene 18.3数据库进行比对。α多样性指标（Richness、Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Phylogenetic diversity whole tree indices）利用R语言vegan包,β多样性指标（weighted Uni Frac,unweighted Uni Frac,Jaccard distance,Bray‐Curtis dissimilarity）利用q2‐diversity并通过置换多元方差分析比较组间差异。差异菌门、菌属筛选采用LEf Se方法并进行线性判别分析。菌属相关性比较采用Spearman相关性分析。差异菌群的功能分析利用PICRUSt2软件进行预测并采用LEf Se计算组间差异。3、非靶向代谢组学测序相关代谢物分析组织代谢物按常规标准进行提取后通过Vanvosh超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS/MS）系统与Orbitrap Q Exactive TM HF质谱仪结合Hypesil Gold色谱柱上机进行测序。下机数据进行搜库并与mzCloud、mzVault和Mass List数据库匹配获取代谢物定性和相对定量结果。代谢物注释使用HMDB数据库并进行主成分分析。差异代谢物分析采用Mann–Whitney U检验。代谢功能分析通过KEGG数据基于Metabo Analyst 5.0网站进行。4、胃癌微生物-代谢物相关性及共存分析微生物与代谢物的整体相关性分析采用M2IA线上分析流程的PA和O2PLS分析手段,差异微生物与代谢物的相关性利用Spearman相关性分析进行,共存关系采用Qiime2平台的mmvec神经元网络算法分析。第二部分:具核梭杆菌感染与胃癌发病风险、临床病理参数及预后的关联研究1、病例选择:中国医科大学附属第一医院肛肠外科2012年6月至2014年6月接受胃大部切除术的53例胃癌患者,庄河胃癌筛查及早诊早治项目2004年受检的浅表性胃炎78例、萎缩性胃炎59例。样本保存方式、知情同意、病历资料收集及随访方式同论文第一部分。2、利用TIANamp Micro DNA Kit微量样品基因组DNA提取试剂盒提取质量不超过10mg组织的基因组DNA,利用本课题组前期常规DNA提取方法提取质量超过10mg组织的基因组DNA。利用实时荧光定量PCR检测胃黏膜组织基因组DNA中具核梭杆菌的丰度,相对丰度按照相对定量2-ΔCt方法进行计算。3、胃癌及其远端正常组织具核梭杆菌丰度差异采用配对秩和检验。具核梭杆菌感染与胃癌发病风险的相关性研究采用Logistic回归分析。具核梭杆菌感染与临床病理参数的关联分析按照病理参数分组后采用Mann–Whitney U检验。利用X-tile软件分析胃癌预后相关的具核梭杆菌DNA高低丰度分界值并基于高低丰度进行Kaplan-Meier生存分析及COX单因素、多因素分析。第三部分:具核梭杆菌影响胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞生物学行为的作用机制研究1、细胞系和菌种的选择:GES-1永生化人胃黏膜上皮细胞系购自杭州美森细胞科技有限公司。AGS胃癌细胞系及HGC27胃癌细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。三种细胞均具有STR鉴定证书。具核梭杆菌菌株（ATCC25586）由中国医科大学附属口腔医院牙周教研室馈赠。2、利用共培养细胞裂解液革兰氏染色、琼脂平板法及激光共聚焦显微镜观察具核梭杆菌对胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞的黏附、侵入能力。3、利用CCK-8实验检测具核梭杆菌感染后细胞活性、细胞增殖行为的变化,利用流式细胞学检测具核梭杆菌感染后早期、晚期凋亡细胞比例。4、利用Trizol法提取细胞总RNA,利用Mon Script TMRTIII All-in-One Mix with ds DNase反转录后应用实时荧光定量PCR检测具核梭杆菌感染后细胞GSS、GPX4mRNA表达量变化。5、提取实验和对照组细胞蛋白,利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度并定量后进行western blot实验,检测具核梭杆菌感染后GSS、GPX4蛋白表达量的变化。6、按照微量还原型谷胱甘肽测定试剂盒操作流程,使用酶标仪检测实验组及对照组细胞内还原型谷胱甘肽的含量。7、按照细胞内活性氧测定试剂盒操作流程,使用荧光酶标仪检测实验组及对照组细胞内活性氧含量。研究结果:第一部分:不同梭杆菌属感染状态胃癌表型特征分析1、胃癌组织梭杆菌属感染状态利用Qiime2 16s Deblur降噪手段分析16s rRNA测序数据获得微生物s OTU绝对丰度,以梭杆菌属绝对丰度分为阳性及阴性两组,发现近半数胃癌组织有梭杆菌属感染。2、不同梭杆菌属感染状态胃癌临床病理参数的差异胃癌梭杆菌属感染状态与临床病理参数进行关联分析后,老年胃癌患者更易发生梭杆菌属感染（P=0.041）。梭杆菌属感染与癌周淋巴细胞浸润相关（P=0.040）,但与性别、肿瘤大小、分化程度、Lauren分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、脉管癌栓、TNM分期等一般临床病理参数无关（P>0.05）。在肿瘤标记物表达方面,梭杆菌属感染状态与突变型p53的阳性表达相关（P=0.016）,但与CEA、Ki67、C-er B-2表达无关（P>0.05）。3、不同梭杆菌属感染状态胃癌预后的差异在Kaplan-Meier生存分析中,梭杆菌属阳性与阴性胃癌患者总生存时间无显著差异（P=0.899）。COX单因素分析将P<0.1的指标（肿瘤大小、分化程度、浸润深度、脉管瘤栓、淋巴结转移、TNM分期）纳入多因素分析后,在各临床病理参数指标分组中梭杆菌属感染均不能作为预后的独立风险因素（P>0.05）。4、不同梭杆菌属感染状态胃癌组织微生物群分布差异梭杆菌属阳性胃癌组织菌群的α多样性（Richness,Chao1指数,ACE指数,faith-PD＿whole＿tree）高于阴性组织（P<0.05）。在微生物群分布上,β多样性三种指标在组间存在差异（P<0.05）。利用LEf Se筛选组间差异菌属并构建菌属相关网络,发现梭杆菌属阳性组织中菌属相关性较多。5、不同梭杆菌属感染状态胃癌组织代谢物富集差异、微生物相关代谢通路差异及微生物-代谢物相关性、共存分析利用非靶向代谢组学测序对胃癌组织中代谢物进行定性定量,U检验结果发现11种代谢物在组间存在富集差异（P<0.05）。利用PICRUST2预测微生物相关代谢通路后,赖氨酸、肽聚糖和氨酰基-tRNA生物合成3种代谢通路在组间存在差异（P<0.05）。利用PA及O2PLS发现微生物及代谢物间存在整体相关性。通过微生物-代谢物Spearman相关性分析和mmvec共存分析发现三种代谢物（还原型谷胱甘肽、尿酸、焦磷酸盐）与梭杆菌属共存且呈负相关。第二部分:具核梭杆菌感染与胃癌发病风险、临床病理参数及预后的关联研究1、具核梭杆菌感染与胃癌发病风险的关联分析利用Real-Time PCR方法检测组织中具核梭杆菌丰度,同一个体胃癌及其远端正常组织配对秩和检验结果提示具核梭杆菌在胃癌组织中丰度显著高于其远端正常组织（P<0.001）。对浅表性胃炎、萎缩性胃炎分别与胃癌进行Logistic回归分析并发现:与浅表性胃炎相比,具核梭杆菌高丰度发生胃癌的风险是低丰度的5.189倍（P<0.01）;与萎缩性胃炎相比,具核梭杆菌高丰度发生胃癌的风险是低丰度的11.250倍（P<0.01）。2、具核梭杆菌感染与胃癌临床病理参数的关联分析在所有临床病理参数中仅有肿瘤大小与具核梭杆菌丰度相关:肿瘤直径大于6cm的胃癌患者具核梭杆菌含量较高（P<0.05）,其余参数均无明显相关（P>0.05）,但丰度趋势在年龄、癌周淋巴细胞浸润和p53表达方面与论文第一部分结果具有一致性。3、具核梭杆菌感染与胃癌预后的关联分析利用X-tile软件分析得到判定患者预后信息的最佳临界值并据此将胃癌组织分为具核梭杆菌高丰度与低丰度两组。利用Kaplan-Meier生存分析发现具核梭杆菌高丰度患者总生存期具有较短趋势（P=0.148）,利用COX单因素回归分析发现具核梭杆菌高丰度胃癌有不良预后的趋势:高丰度胃癌死亡风险是低丰度的1.893倍（P>0.05）。4、具核梭杆菌感染与胃癌代谢物的关联分析在胃癌具核梭杆菌高丰度组织中还原型谷胱甘肽含量可见降低趋势（P>0.05）,将具核梭杆菌DNA表达的2-ΔCt值与还原型谷胱甘肽代谢物含量进行Spearman相关性分析后发现二者为负相关（r=-0.277,P>0.05）。第三部分:具核梭杆菌影响胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞生物学行为的作用机制研究1、具核梭杆菌对胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞的黏附与侵入在共培养细胞裂解液中可检测到具核梭杆菌革兰氏染色呈阴性,裂解液进行琼脂平板铺板后可观察到具核梭杆菌菌落生长,免疫荧光染色后在激光共聚焦镜下观察到具核梭杆菌能够黏附在胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞表面并侵入到细胞内。与侵入黏附相关的mRNA表达水平检测中,具核梭杆菌感染有促进GES-1细胞E-cadherin mRNA表达,抑制AGS及HGC27胃癌细胞E-cadherin mRNA表达的趋势。2、具核梭杆菌影响胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞活性CCK-8实验发现在MOI=1时,具核梭杆菌增加AGS细胞活性（P<0.05）,少量抑制HGC27细胞活性（P<0.05）,有增加GES-1细胞活性的趋势。在MOI=10时,具核梭杆菌能抑制胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞活性（P<0.05）。流式细胞学检测发现MOI=10时具核梭杆菌使正常细胞/总细胞比例降低,使早期、晚期凋亡细胞/总细胞比例增高（P<0.05）。3、具核梭杆菌影响胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞内GSH及ROS含量在MOI=10时,具核梭杆菌抑制胃癌细胞GSH生成,促进胃黏膜上皮细胞GSH生成（P<0.05）。在MOI=1时,GSH含量在组间无统计学意义（P>0.05）。细胞内ROS检测发现:随着具核梭杆菌含量增高,胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞内ROS呈先增高后降低的趋势,AGS细胞在MOI=1时呈最高态,HGC27细胞和GES-1细胞在MOI=1与10时均呈现为ROS的降低。4、具核梭杆菌影响胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞GSH合成酶（GSS）的表达在MOI=1时,具核梭杆菌对三种细胞GSS mRNA表达的影响不具有统计学意义（P>0.05）,对HGC27细胞GSS的蛋白表达起促进作用（P<0.05）并有促进AGS和GES-1细胞GSS蛋白表达的趋势。在MOI=10时,具核梭杆菌抑制AGS细胞GSS mRNA的表达（P<0.05）,对GES-1和HGC27细胞GSS mRNA和蛋白表达的影响不具有统计学意义（P>0.05）,但有促进GES-1细胞GSS mRNA和蛋白表达的趋势及抑制HGC27细胞GSS mRNA和蛋白表达的趋势。5、具核梭杆菌影响胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞GSH过氧化物酶4（GPX4）的表达在MOI=1时,具核梭杆菌抑制AGS细胞GPX4 mRNA表达（P<0.05）并有抑制其蛋白表达的趋势,对GES-1细胞GPX4 mRNA和蛋白表达均有促进作用（P<0.05）,对HGC27的影响无统计学差异。在MOI=10时,具核梭杆菌抑制AGS细胞GPX4 mRNA表达（P<0.05）并在蛋白表达水平呈与mRNA水平相同趋势,对HGC27细胞和GES-1细胞GPX4蛋白表达有促进作用（P<0.05）并在mRNA表达水平呈与蛋白水平相同趋势。研究结论:1、不同梭杆菌属感染状态胃癌表型特征存在差异,胃癌梭杆菌属感染状态与癌周淋巴细胞浸润、突变型p53的阳性表达、微生物群落多样性分布及3种代谢物的富集相关。2、具核梭杆菌在胃癌组织高度富集,增加胃癌发病风险并有致不良预后的趋势。3、具核梭杆菌具有黏附并侵入胃黏膜上皮及胃癌细胞的能力,可通过调控GSH合成酶及GSH过氧化物酶4表达影响胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞GSH和ROS的生成抵抗胃黏膜上皮细胞凋亡并促进胃癌细胞增殖。