肺癌是全球范围内导致癌症死亡的首要原因,而非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最主要的类型,约占85%。手术是对非小细胞肺癌最为有效的治疗方法,然而大部分肺癌患者在就诊时肿瘤已进展从而失去了手术的机会。虽然越来越多的治疗方案如化疗、放疗、分子靶向治疗及免疫治疗等被证明对肺癌有效,但肺癌患者的整体预后仍不令人满意,5年生存率仅为11%。我们迫切地需要进一步深入了解肺癌的发生发展机制,探索新的癌基因及抑癌基因作为潜在的治疗靶标。血小板生成素（TPO）是一种主要由肝脏及肾脏分泌的造血细胞因子,主要作用为调节巨核细胞的增殖与分化,促进血小板生成。近些年来,有研究发现TPO的作用不仅局限于造血系统,其在神经细胞、心肌细胞及卵巢组织中都发挥相应的作用。但TPO在实体肿瘤,尤其是肺癌中的研究仍十分匮乏,在正常情况下,外源性的TPO通过与其受体MPL proto-oncogene（C-MPL）结合进而激活一系列信号传导通路。已有大量研究证实,包括肺癌在内的绝大部分的实体肿瘤组织及细胞系都缺乏C-MPL的表达,由此外源性的TPO对肺癌细胞无法起到作用。在本研究中,我们发现TPO在NSCLC细胞中高表达但并未分泌到细胞外,而这部分由肺癌细胞表达的内源性TPO对肺癌的发生发展是否存在作用及其作用机制是本文探讨的重点。目的:探究TPO在非小细胞肺癌组织中的表达情况及其与临床病理因素的关系;探究TPO对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移的作用及其分子机制。研究方法:选取2014-2016年就诊于中国医科大学附属第一医院胸外科的肺癌患者组织标本150例,所有标本均由手术切除获得,且术前未接受放化疗。通过免疫组化实验检测TPO在肺癌组织中的表达情况,并利用统计学分析TPO的表达与淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期、年龄、性别、肿瘤类型以及分化程度之间的关系。通过免疫印迹实验（Western Blot）、实时定量PCR技术及酶联免疫吸附测定实验（ELISA）对5种非小细胞肺癌细胞系及正常支气管上皮细胞HBE中TPO的蛋白表达、m RNA表达及细胞上清液中TPO的表达水平进行检测。在肺癌细胞中过表达及敲减TPO后通过CCK8、克隆形成及Transwell实验检测TPO对肺癌细胞增殖、迁移能力的影响。通过Western Blot实验检测增殖迁移相关蛋白及信号通路关键分子的表达情况。利用质谱分析技术预测肺癌细胞中可能与TPO存在相互作用的蛋白并通过免疫共沉淀（Co-IP）实验进行验证。细胞免疫荧光实验探究TPO在肺癌细胞中的定位及与EGFR蛋白定位的相关性。通过PCR及Western Blot实验检测TPO对EGFR转录水平以及蛋白降解速率的影响。结果:1.150例非小细胞肺癌组织免疫组化结果提示癌组织中TPO的表达量显著高于癌旁及正常肺组织,统计分析显示TPO的表达与肺癌的淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度相关。2.与正常支气管上皮细胞HBE相比,TPO在A549,H1299,SK-MES-1和H292这四种肺癌细胞中呈现高表达,在H460细胞中呈现低表达。而在HBE及上述5种肺癌细胞上清液中均未检测出TPO。3.在所选取的A549及H1299细胞中敲减TPO,CCK8、克隆形成及Transwell实验结果显示这两种细胞的增殖及迁移能力降低。进一步检测了增殖迁移相关蛋白的表达,发现敲减TPO后cyclin E1、cyclin E2、CDK2、c-Myc、Rho A和Rho C的表达量降低而P27的表达量升高。4.在A549及H1299细胞中过表达TPO,CCK8、克隆形成及Transwell实验结果发现这两种细胞的生物行为学功能并未发生改变。5.在A549及H1299细胞中敲减TPO,检测参与调控细胞增殖、迁移的常见信号通路关键蛋白表达量。Western Blot结果显示P-AKT（Ser473）及P-mTOR（Ser2448）的表达显著降低,而P-ERK、P-MEK、P-P65、P-JNK、activeβ-catenin及P-YAP的表达量未见明显变化。6.结合质谱分析结果及PI3K/AKT/mTOR通路的活性变化,我们预测TPO可能与EGFR存在相互作用进而调控其通路活性。免疫共沉淀（Co-IP）实验证实了在A549及H1299细胞中TPO与EGFR存在相互作用。进一步在这两种细胞中敲减TPO,Western Blot结果显示P-EGFR（Tyr1068）的表达量显著降低,而EGFR总量的变化不明显,无统计学意义。7.PCR结果提示在A549及H1299中敲减TPO,EGFR的m RNA水平并未出现下降,反而出现了上升,这说明TPO对EGFR蛋白及EGFR通路活性的调控作用发生在翻译后修饰阶段。进一步探究TPO是否对EGFR的降解过程起到作用,在上述两种细胞中分别敲减及过表达TPO,饥饿处理后加入放线菌酮抑制蛋白质合成,予以EGF刺激,并在不同时间点检测EGFR及P-EGFR（Tyr1068）的变化。结果提示TPO可以通过延缓配体结合后EGFR的降解进而上调EGFR通路活性,使其持续激活。8.A549及H1299均为EGFR野生型细胞,在无外源性EGF刺激条件下,其EGFR通路活性较低。综合上述结果,我们猜测在这两种细胞中过表达TPO并未影响其生物行为学功能可能是由于EGFR通路活性低,限制了TPO的作用空间。进而我们在过表达TPO的A549及H1299细胞中持续加入EGF刺激,CCK8、克隆形成及Transwell实验结果显示上调TPO显著提高了EGF刺激下这两种细胞的增殖及迁移能力,Western Blot实验也表明P-AKT（Ser473）、P-mTOR（Ser2448）、cyclin E1、cyclin E2、CDK2、c-Myc、Rho A和Rho C的表达量升高而P27的表达量下降。结论:1.TPO在非小细胞肺癌组织中高表达,TPO的表达与淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度相关。2.TPO通过上调EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肺癌细胞的增殖和迁移能力。3.TPO可能通过延缓配体结合后EGFR的降解速率进而使得EGFR通路持续激活。