目的:胃癌是世界第五常见的癌症,也是第三大癌症死亡原因的疾病。尽管随着手术技术的改进以及放化疗的应用显著提高了胃癌患者的长期生存率,但那些被诊断为中晚期胃癌的患者仍然具有较高的死亡率,造成其预后不良的主要原因是肿瘤细胞发生了转移,因此了解胃癌侵袭和转移的机制对于寻找治疗胃癌的可能方法起到至关重要的作用。长链非编码RNA（lncRNA）是一类不编码蛋白、参与细胞内生物学过程的200nt以上RNA分子。lncRNA的特性有很多,包括组织器官特异性与时间特异性。在不同组织中,lncRNA表达量不尽相同,并且当我们处于不同的生长时期,lncRNA表达量也会发生变化。目前研究发现,lncRNA可以参与胃癌的表观遗传学以及转录和转录后调控,对胃癌的增殖分化起着重要作用,但是在胃癌侵袭转移方面的研究甚少。加权共表达分析（WGCNA）是一种利用权重算法进行的高效准确的数据挖掘方法。加权共表达分析致力于通过对基因表达量与疾病表型的精准计算,构建以表型为分类的基因共表达的模块,由此可以探索和研究感兴趣的表型与模块内基因之间的联系。模块是由一组具有相关性表达量的基因构成,在构建加权共表达网络时,如果一些基因在不同个体组织中的表达变化总是相似的,或者说有相似的表达趋势,那么我们就可以推测这些表达相似的基因具有相似的功能,把他们组合成一起就组成了一个模块。加权共表达网络是将复杂的基因网络简化为一个个相对简单的模块,也就是说一个模块就相当于一个“超级基因”,它的功能是由这个模块中所有基因共同决定的。目前,由于lncRNA的功能研究的相对较少,人们对其的了解还远没有mRNA的深入,因此当我们将患者的基因mRNA表达量和lncRNA表达量混合在一起,利用加权共表达网络得出lncRNA与mRNA数据相混合的模块,通过对mRNA的功能分析就可以近似地了解相同模块中lncRNA的功能。通过这种方法,我们就可以探寻到我们感兴趣的lncRNA以及其功能,从而有效地提高了科研效率。上皮-间充质转化（EMT）是一种在进化上保守的发育程序,已经被证实与细胞癌变密切相关。研究表明EMT通过增强细胞的侵袭、移动和对凋亡刺激的抗性而赋予癌细胞转移的特性。因此EMT的复杂生物过程被认为是癌症转移的的关键标志,靶向EMT途径是癌症治疗中的一种有吸引力的策略。TWIST家族转录因子2（twist family b HLH transcription factor 2,TWIST2）,作为一种转录因子,可以通过调控间质细胞的转录,激活或抑制下游靶基因,从而影响间质细胞的发生和发育。本研究的目的是通过对TCGA数据库的数据筛选与整合,利用WGCNA的算法,寻找与胃癌转移相关的lncRNA,并且探讨其调控的相关机制,为进一步对胃癌分子机制的探索提供理论依据。研究方法:我们利用TCGA数据库筛选出有表达差异和生存意义lncRNAs,从中选择出我们感兴趣作为我们的主要研究目标。通过RT-qPCR验证LINC01235在GES-1、SGC-7901、MGC-803、AGS和HGC27细胞系中的表达量,挑选出适合我们继续实验所使用的细胞系。同时比较LINC01235在48对临床胃癌组织及癌旁组织中的表达量,相关性分析探索LINC01235与临床病理学因素的相关性。利用TCGA数据库及进行GSEA分析,探索LINC01235可能参与的相关通路,进一步用免疫荧光定量分析检测该通路中标志性基因的表达量,验证LINC01235对相关通路的影响。划痕和Transwell实验进一步验证LINC01235对胃癌细胞侵袭和迁移的影响。裸鼠尾静脉注射稳转的对照组与沉默组的HGC27细胞株,观察肺转移结节的情况。利用TCGA数据库构建加权共表达网络,分析出网络中LINC01235所在的模块,进而进行GO和KEGG预测分析LINC01235参与的生物学功能以及同模块中与LINC01235高度相关的基因。TCGA数据库分析和临床组织检测进一步确认LINC01235与相关基因的相关性。免疫组化检测蛋白表达,并分析生存曲线和表达相关性。Jaspar网站预测转录因子作用于LINC01235的靶点序列,荧光素酶实验和CHIP验证直接结合位点。LncBase,miRWalk and miRDB三个数据库预测可能的miRNA。结果:我们在TCGA数据库中共筛选出18个具有表达差异并且总生存有统计学意义的lncRNAs（P<0.05）。构建WGCNA模型,发现cyan模块中与胃癌T分期高度相关（P=3.2e×10-8）。发现LINC01235是此模块的hub lncRNA。比较TCGA配对的胃癌组织中LINC01235的表达,发现相较于癌旁组织,LINC01235在胃癌组织中高表达（P<0.001）,并且在胃癌细胞系中,HGC27的表达最高。GO分析显示LINC01235参与细胞外基质的组成,KEGG分析显示LINC01235的通路富集在局部黏附和ECM受体的连接。GSEA分析显示LINC01235参与EMT的相关通路。相比较与对照组,沉默LINC01235的HGC27细胞中,E-cadherin的表达量升高,N-cadherin,vimentin and fibrinestin（FN）的表达量降低。免疫荧光实验再一次验证了这个结果。划痕实验显示,沉默LINC01235显著降低胃癌细胞的移动性。Transwell的侵袭和迁移实验同样显示沉默LINC01235抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。在裸鼠尾静脉注射的实验中,对照组相比,注射HGC-27/sh LINC01235的小鼠肺转移性结节较少且较小。TCGA相关分析显示LINC01235与TWIST2的表达呈正相关,相似的结果发生在我们在48对胃癌和癌旁组织中（r=0.63;r=0.405）。RT-qPCR结果显示在LINC01235基因敲减的细胞中,TWIST2表达显著下调。Western印迹显示沉默LINC01235可显著增加E-cadherin的表达,降低vimentin和N-cadherin的表达。然而,过度表达TWIST2逆转了间充质基因的抑制并且使上皮基因的表达下调。在划痕和transwell恢复试验中,进一步证实了TWIST2可以逆转沉默LINC01235细胞的迁移和侵袭能力。我们将LINC01235过表达质粒转染HGC-27和SGC-7901细胞。Western blot显示TWIST2表达增加,THBS2表达呈下降趋势,这表明THBS2可能是LINC01235–TWIST2轴的下游靶点。在恢复实验中,THBS2过表达逆转了TWIST2对EMT的影响。免疫组化显示TWIST2表达与THBS2表达呈负相关（r=-0.506,P<0.001）。生存分析显示高TWIST2表达与预后差相关,而低表达THBS2的预后差。在免疫荧光分析中,我们发现癌组织中绿色荧光（TWIST2）的强度明显高于红色荧光（THBS2）,而在邻近组织中,我们观察到相反的情况,相关分析的差异具有统计学意义（r=-0.448,P<0.001）。TWIST2在HGC-27和SGC-7901细胞中的过度表达梯度表明LINC01235的表达也增加。我们在Jaspar网站上调查了TWIST2在基因组LINC01235中的预测结合位点,并使用荧光素酶测试来验证外转TWIST2表达增强了来自野生型LINC01235启动子的萤火虫荧光素酶的转录。当TWIST2结合序列被删除时,萤火虫荧光素酶表达显著降低（P<0.01）。我们还进行了ChIP实验,以确定TWIST2是否与细胞中的LINC01235启动子结合。如预期,RT-qPCR结果显示TWIST2组高于IgG对照组（P<0.001）。为了探讨LINC01235对TWIST2的调控作用,我们在LncBase、miRWalk和miRDB三个数据库中对靶基因进行了预测和分析。维恩图显示miR-6852-5p可能是LINC01235调控TWIST2的关键靶点miRNA。TCGA数据库分析显示miR6852-5p的表达与LINC01235和TWIST2呈负相关,这进一步证实了我们的想法。结论:LINC01235-TWIST2正反馈环主要影响GC细胞的迁移和侵袭,TWIST2可以正反馈LINC01235的表达,THBS2是该环路的下游靶点。这些结果说明LINC01235可能成为胃癌治疗的潜在靶点。