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目的:恶性胶质瘤是一种常见的中枢神经系统肿瘤,常规手术切除并辅助化疗后的治疗效果并不理想,一般认为胶质瘤患者预后差的一个重要原因就是其对化疗药物的耐药性,但造成耐药的具体机制目前不明。目前获得较多支持的理论和假说认为是胶质瘤干细胞（Glioma stem cells,GSCs）自身对化疗药物的抗性以及在脑胶质瘤中多药耐药蛋白的异常表达是胶质瘤患者产生化疗耐药的主要原因。GSCs是指胶质瘤中部分具有无限增殖以及多向分化潜能的细胞亚群,P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）以及三磷酸腺苷结合盒转运体G2（ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2）则是常见的和胶质瘤耐药相关的多药耐药蛋白。抑制GSCs的增殖以及降低胶质瘤中P-gp和ABCG2的表达可能对减少胶质瘤的耐药性有重要意义。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythorid-2-related factor 2,Nrf2）及其相关通路在胶质瘤中治疗的作用是近年来的研究热点,研究发现Nrf2和其调控的下游基因在胶质瘤细胞特别是在GSCs中的高表达促进了胶质瘤细胞的增殖并增加了胶质瘤对化疗药物的抗性。团队之前研究发现低频低强度超声（Low frequency and low intensity ultrasound,LFLIU）与姜黄素联合作用可以通过调控PI3K/Akt或Nrf2信号通路抑制胶质瘤细胞的增殖和多药耐药蛋白的表达。近来,随着二甲双胍（Metformin,MET）可以辅助化疗药物治疗脑胶质瘤等作用的不断被发现,LFLIU联合MET是否具有抑制GSCs增殖并影响Nrf2、P-gp和ABCG2表达的潜在作用成为一个待研究的问题。本研究将在团队前期发现的基础上通过体外实验和体内实验,探讨LFLIU联合MET对胶质瘤细胞以及GSCs的增殖是否具有抑制作用,以及联合作用能否降低GSCs中Nrf2、P-gp和ABCG2的表达,并推测了Nrf2对GSCs增殖以及P-gp和ABCG2表达的影响。研究方法:1.本研究首先从U-87 MG、U251中利用无血清培养法培养并分离鉴定出U-87 MG-GSCs、U251-GSCs细胞。分别使用LFLIU、MET以及LFLIU+MET联合作用于U-87 MG、U251、U-87 MG-GSCs以及U251-GSCs细胞。基于团队之前的研究,LFLIU频率选择为1 MHZ,超声照射深度5mm,增益5d B,作用强度为142.0m W/cm2,作用时间为60s,MET作用浓度为10m M。CCK8法分别检测LFLIU、MET以及LFLIU与MET联合作用于U-87 MG、U251、U-87 MG-GSCs以及U251-GSCs之后的吸光值,并计算各种干预方法对细胞增殖的抑制率。2.建立免疫缺陷动物（裸小鼠）的U251-GSCs的原位移植模型,利用核磁共振动态监测和评估肿瘤生长情况,通过HE染色观察肿瘤的形态结构,使用免疫组化检测并半定量分析Nrf2、P-gp、ABCG2、Ki-67以及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达,同时在各干预组中随机留取部分荷胶质瘤裸小鼠进行生存分析。3.利用聚合酶链反应、Western Blot分别检测体外、体内实验中使用LFLIU、MET以及LFLIU+MET联合作用后U251-GSCs中Nrf2、P-gp及ABCG2在基因转录和蛋白水平表达的变化。4.利用慢病毒转染U251-GSCs调低其Nrf2表达,CCK8法检测U251-GSCs转染后对细胞增殖的影响,PCR、Western Blot检测调低U251-GSCs中Nrf2的表达后P-gp和ABCG2在基因转录及蛋白水平表达的变化。结果:1.采用无血清培养法,培养并传代含U-87 MG-GSCs以及U251-GSCs的胶质瘤细胞球,利用流式细胞术测胶质瘤细胞球中CD133+的GSCs比例。CD133+的U-87 MG-GSCs在神经肿瘤球中的平均比例为0.93%,CD133+的U251-GSCs在神经肿瘤球中的平均比例为0.87%。2.U-87 MG组MET、LFLIU以及MET+LFLIU分别作用后48小时细胞增殖抑制率分别为（22.53±3.18）%、（19.77±3.03）%、（24.51±3.39）%,作用后72小时细胞增殖抑制率分别为（36.27±4.17）%、（33.24±4.74）%、（48.63±5.15）%;U251组MET、LFLIU以及MET+LFLIU分别作用后48小时细胞增殖抑制率分别为（23.76±3.36）%、（19.89±3.12）%、（26.58±3.51）%,作用后72小时细胞增殖抑制率分别为（35.91±4.62）%、（34.26±4.29）%、（50.69±5.82）%;U-87MG-GSCs组MET、LFLIU以及MET+LFLIU分别作用后48小时细胞增殖抑制率分别为（27.11±3.59）%、（28.98±3.78）%、（31.38±4.08）%,作用后72小时细胞增殖抑制率分别为（38.88±4.37）%、（35.61±4.47）%、（55.86±6.09）%;U251-GSCs组MET、LFLIU以及MET+LFLIU分别作用后48小时细胞增殖抑制率分别为（30.78±3.81）%、（29.51±3.24）%、（35.46±4.17）%,作用后72小时细胞增殖抑制率分别为（45.39±4.41）%、（39.78±4.83）%、（68.16±9.15）%;不同干预方法应用后的48小时各组细胞增殖水平差异不明显;与单独使用MET或LFLIU相比,MET与LFLIU联合应用在作用后的72小时对各组细胞的增殖有明显抑制作用,存在统计差异（P<0.05）;MET与LFLIU联合组对U251-GSCs的抑制增殖作用较U-87 MG、U251以及U-87 MG-GSCs更为明显（P<0.05）。3.LFLIU、MET以及LFLIU+MET联合作用荷瘤裸小鼠后,其中以LFLIU+MET联合作用后减慢荷瘤裸小鼠颅内肿瘤生长速度的效果最为显著（P<0.05）;与Control组及单独处理组（LFLIU组、MET组）相比,LFLIU+MET联合作用后的荷瘤裸小鼠的生存时间更长（P<0.05）。4.在体外实验和体内实验中发现,Nrf2、P-gp和ABCG2在Control组内均呈高表达,与Control组以及单独处理组（LFLIU组或MET组）相比,LFLIU+MET联合作用后U251-GSCs内Nrf2、P-gp和ABCG2的在基因转录和蛋白水平表达量均下降（P<0.05）。5.阴性对照组（Scrambled）对U251-GSCs的细胞增殖无明显抑制作用,U251-GSCs转染组（U251-GSCs-Nrf2-down）对U251-GSCs增殖的抑制作用很明显,与Scrambled组相比存在统计差异（P<0.05）。U251-GSCs-Nrf2-down组Nrf2、P-gp与ABCG2在基因转录和蛋白表达水平的表达明显低于对照组和Scrambled组（P<0.05）,Scrambled组Nrf2、P-gp与ABCG2表达与对照组的差异无统计学意义。结论:1.LFLIU+MET联合干预与LFLIU、MET单独作用相比,对胶质瘤细胞及GSCs的增殖有更明显的抑制作用,LFLIU+MET可抑制荷瘤裸小鼠颅内肿瘤增长速度,延长其生存时间。2.LFLIU+MET在体内和体外两个方面均可以抑制U251-GSCs内Nrf2、P-gp和ABCG2在基因转录水平的变化并影响Nrf2、P-gp和ABCG2在蛋白水平的表达,LFLIU+MET与LFLIU、MET单独作用相比具有更明显逆转胶质瘤多药耐药性的作用。3.LFLIU和/或MET联合干预抑制GSCs的增殖,减缓荷瘤裸小鼠颅内肿瘤增长,延长荷瘤裸小鼠生存时间,下调P-gp和ABCG2在基因转录和蛋白水平表达可能均与Nrf2及其通路调控有关。4.由于MET的相对安全性以及LFLIU作用方式的超选择性,LFLIU和MET联合干预是一种有前途的胶质瘤辅助治疗手段。