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目的:上皮性卵巢癌（EOC）是常见的妇科恶性肿瘤,早期阶段没有明显的症状,大多数患者被诊断时已为晚期,远期预后差,严重影响女性健康。环状RNA（circ RNA）含几百至几千个核苷酸、它稳定的共价闭合环状结构富含微小RNA（mi RNA）结合位点,能够吸附并解除微小RNA对靶基因表达的抑制作用,参与竞争性内源RNA网络,并通过调控癌基因或抑癌基因的表达,影响肿瘤的发生发展。外泌体是直径为30-100nm的细胞外囊泡,能够携带蛋白质、核酸等生活性物分子,转移到远处器官或邻近细胞,参与细胞间交流。癌细胞分泌的外泌体能够为肿瘤存活、血管生成和侵袭构建有利的环境。最近的研究表明,circ RNA可以转移至外泌体,并在外泌体中显著富集。但是,在卵巢癌中circ RNA的表达谱和生物学功能,以及它们在外泌体中的形式,在很大程度上仍然未知。本研究中,我们着重探索环状RNA PUM1及其外泌体形式在卵巢癌中的作用及具体机制。研究方法:1、利用qRT-PCR在15例正常卵巢、11例良性卵巢肿瘤与76例上皮性卵巢癌组织中检测环状RNA PUM1的表达。2、细胞培养与转染:用p LCDH-circ PUM1质粒稳定转染circ PUM1低表达的卵巢癌CAOV3细胞。利用靶向成环接口处的sh-circ PUM1-GFP质粒转染circ PUM1高表达的A2780细胞,解除circ PUM1的环状结构。利用嘌呤霉素筛选转染细胞,建立circ PUM1过表达和沉默的细胞系。3、通过MTT法在上述circ PUM1高、低表达细胞系及各自对照组测定细胞增殖能力。4、利用7AAD/PE-labeled Annexin V将上述circ PUM1高、低表达细胞系及各自对照组染色,流式细胞术分析环状RNA PUM1对卵巢癌细胞凋亡的影响。5、划痕实验:在上述circ PUM1高、低表达细胞系及各自对照组进行划痕实验,通过测定伤口愈合率,分析环状RNA PUM1对卵巢癌细胞迁移能力的影响。6、Transwell实验:在上述circ PUM1高、低表达细胞系及各自对照组,利用Transwell实验明确环状RNA PUM1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响。7、裸鼠腹腔注射成瘤模型:选取BALB/c裸鼠腹腔内分别注射1×107个上述circ PUM1敲除及对照组卵巢癌细胞,4周后处死裸鼠并解剖腹腔,明确环状RNA PUM1对卵巢癌细胞体内成瘤及转移能力的影响。8、双荧光素酶报告基因实验:用野生或突变的双荧光素酶报告基因质粒与mi R-615-5p或mi R-6753-5p模拟物及对照,共转染HEK-293T细胞,测定荧光素信号相对强度。9、卵巢癌细胞中mi R-615-5p和mi R-6753-5p的功能进行探究:分别在CAOV3和A2780细胞转染mi R-615-5p或mi R-6753-5p,进行上述细胞增殖、凋亡、划痕及Transwell实验。10、验证环状RNA PUM1吸附mi R-615-5p和mi R-6753-5p影响卵巢癌细胞表型:在circ PUM1高表达细胞系中进一步过表达mi R-615-5p及mi R-6753-5p,进行上述细胞增殖、凋亡、划痕及Transwell实验。11、Western blot:在卵巢癌细胞系CAOV3和A2780分别转染mi R-615-5p、mi R-6753-5p检测其靶标NF-κB2、MMP2的表达;在circ PUM1高表达细胞及裸鼠腹腔注射沉默circ PUM1细胞的成瘤组织与各自对照组检测NF-κB2、MMP2的表达;在circ PUM1高表达细胞系中进一步过表达mi R-615-5p或mi R-6753-5p,检测NF-κB2、MMP2的表达。12、外泌体提取与鉴定:利用外泌体抽提试剂盒从circ PUM1高表达及对照组CAOV3细胞培养上清中提取外泌体,Western Blot检测外泌体标志物的表达、电镜观察鉴定外泌体形态。13、外泌体环状RNA PUM1与腹膜间皮细胞共培养:将上述外泌体环状RNA PUM1及对照组外泌体与人腹膜间皮细胞共培养,利用光学显微镜观察间皮细胞形态的改变,Western blot检测间质细胞标志物及circ PUM1下游靶点NF-κB2、MMP2的蛋白表达。14、裸鼠腹腔注射外泌体环状RNA PUM1:裸鼠腹腔内注射CAOV3细胞成瘤后,分别给予环状RNA PUM1过表达及对照组CAOV3细胞培养上清中外泌体刺激。3周后处死裸鼠,解剖腹腔,观察瘤体大小及腹腔内转移灶数量,取腹膜组织行HE染色观察结构形态,Western Blot检测腹膜组织上述蛋白的表达。结果:1、QRT-PCR结果显示circ PUM1在卵巢癌组织中表达上调（P<0.05）,且与FIGO分期成正比（P<0.05）。2、QRT-PCR结果显示:过表达环状RNA PUM1后CAOV3细胞的circ PUM1表达水平显著升高（P<0.05）;解除circ PUM1环状结构后,A2780细胞中的circ PUM1表达水平显著降低（P<0.05）,提示环状RNA PUM1高、低表达卵巢癌细胞系成功建立。3、MTT实验结果显示:过表达环状RNA PUM1促进CAOV3细胞增殖（P<0.05）,沉默环状RNA PUM1后,A2780细胞活力明显降低（P<0.05）。4、细胞凋亡实验结果显示:过表达环状RNA PUM1抑制细胞凋亡（P<0.05）,沉默环状RNA PUM1后,细胞凋亡显著增加（P<0.05）。5、划痕实验发现:过表达环状RNA PUM1后,CAOV3细胞迁移能力显著提高（P<0.05）,沉默环状RNA PUM1后,A2780细胞迁移显著降低（P<0.05）。6、Transwell实验结果显示:过表达环状RNA PUM1后,细胞侵袭能力显著提高（P<0.05）,沉默环状RNA PUM1后,细胞侵袭能力显著降低（P<0.05）。7、裸鼠腹腔注射成瘤结果显示:相比于对照组,注射circ PUM1沉默的裸鼠腹腔内瘤体更小,瘤结节总数更低（P<0.05）。8、双荧光素酶报告基因实验:与突变型相比,mi R-615-5p和mi R-6753-5p均显著降低了野生型circ PUM1荧光素酶质粒的相对荧光素酶活性（P<0.05）,证实环状RNA PUM1与mi R-615-5p及mi R-6753-5p相结合。9、卵巢癌细胞CAOV3及A2780中mi R-615-5p和mi R-6753-5p的功能进行探究:MTT实验发现过表达mi R-615-5p和mi R-6753-5p后,细胞增殖受到抑制（P<0.05）;细胞凋亡实验显示,过表达mi R-615-5p和mi R-6753-5p后,细胞凋亡明显增加（P<0.05）。过表达mi R-615-5p和mi R-6753-5p后,卵巢癌细胞迁移能力被抑制（P<0.05）、细胞侵袭能力降低（P<0.05）。10、在上述circ PUM1高表达细胞系,进一步分别过表达mi R-615-5p或mi R-6753-5p,MMT与细胞凋亡实验结果显示,过表达mi R-615-5p或mi R-6753-5p能够部分逆转细胞中环状RNA PUM1促进细胞增殖（P<0.05）、抑制细胞凋亡的效应（P<0.05）。细胞划痕与Transwell实验显示,circ PUM1高表达的CAOV3细胞中进一步过表达mi R-615-5p或mi R-6753-5p能够部分逆转细胞中环状RNA PUM1促进细胞迁移（P<0.05）、侵袭（P<0.05）的效应。11、再一次利用双荧光素酶报告基因实验证实mi R-615-5p、mi R-6753-5p分别与NF-κB2、MMP2的3’UTR相结合。Western Blot显示卵巢癌细胞系CAOV3、A2780转染mi R-615-5p后,NF-κB2表达下降;转染mi R-6753-5p后,MMP2表达下降。过表达circ PUM1能够上调NF-κB2和MMP2表达水平。另外,裸鼠腹腔内注射沉默circ PUM1细胞的成瘤组织中NF-κB2和MMP2表达水平低于对照组。circ PUM1高表达细胞系进一步分别过表达mi R-615-5p或mi R-6753-5p,NF-κB2、MMP2表达上调的效应受到部分逆转。12、从环状RNA PUM1过表达及对照组CAOV3细胞培养上清中提取外泌体。Western blot证实外泌体特异性标志物HSP-70和CD 9的表达。透射电镜显示外泌体直径为20至100 nm。QRT-PCR结果显示,circ PUM1高表达细胞的上清中分离出的外泌体中存在circ PUM1表达,且高于对照组的表达水平（P<0.05）。13、外泌体环状RNA PUM1处理的HMr SV5细胞形态向成纤维样细胞的转变更明显。Western blot分析显示,circ PUM1外泌体处理的HMr SV5细胞中FAP-1,vimentin,α-SMA,NF-κB2和MMP2的蛋白表达上调。14、外泌体环状RNA PUM1处理的裸鼠腹腔肿瘤灶的数量显著高于对照组。HE染色显示circ PUM1处理腹膜组织间皮细胞排列松散,周围有肿瘤细胞浸润,并在间皮下基质层呈反应性增厚。Western blot显示circ PUM1外泌体处理的腹膜组织中FAP-1,vimentin,α-SMA与circ PUM1下游靶点NF-κB2和MMP2的表达上调。结论:1、环状RNA PUM1在上皮性卵巢癌中表达水平显著高于正常卵巢及良性卵巢肿瘤组织,并与卵巢癌的FIGO分期呈正相关。2、环状RNA PUM1能够促进卵巢癌细胞增殖、迁移与侵袭,减少细胞凋亡,并促进卵巢癌细胞在体成瘤及转移能力。3、环状RNA PUM1通过吸附mi R-615-5p与mi R-6753-5p,解除二者对靶基因NF-κB2和MMP2的抑制作用,从而上调NF-κB2和MMP2的表达,影响卵巢癌细胞表型。4、环状RNA PUM1能够以癌症相关外泌体的形式被腹膜间皮细胞摄取,并诱导腹膜间皮细胞发生“间皮—间充质”转化,促进卵巢癌腹腔播散。