背景：食管癌的恶性程度高,其发病率位于全球恶性肿瘤发病率的第八位,致死率居全世界癌症的第六位。我国是世界上食管癌发病率和致死率最高的国家,在中国最常见的十大恶性肿瘤致死率中,食管癌为第四位。食管癌的预后很差,中晚期食管癌的自然生存期在7-8个月,治疗后的生存情况也很不令人满意,即使治疗手段有了很大改进,然而其5年生存率仍未见较大提高。食管癌的发生具有明显的地区差异性,其高发区从我国西部到中亚,再延伸到伊朗北部,形成典型的“食管癌发病带”,其病理类型主要是鳞状细胞癌。和别的恶性肿瘤一样,食管癌的发生发展也是一个漫长而复杂的过程,涉及多基因、多因素的变异积累以及相互作用等。瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel,TRP channel),是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道超家族,其分为7大亚家族,分别为：TRPC、TRPV、TRPM、RPA、TRPP、TRPN和TRPML。TRP通道家族成员分布广泛,根据已有文献,已知其分布于中枢神经系统、外周神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化道系统、皮肤、泌尿生殖系统及免疫内分泌系统等。TRP通道可作为细胞膜Ca2+通道调节细胞内Ca2+浓度,参与体内跟Ca2+信号相关的许多重要生理过程,细胞的生长及细胞周期、细胞的迁移、细胞坏死等。大量数据表明,TRP通道与肿瘤关系密切,直接参与调控肿瘤的生长、迁移侵袭和分化等,从而导致肿瘤无限制的生长和扩散侵犯等。综合文献数据,我们认为瞬时受体电位通道家族之一的TRPC1可能在食管癌细胞增殖中起着重要的作用。目的：本实验旨在研究TRPC1在人食管癌组织和正常组织中表达情况的差异,及其与食管癌患者临床病理特征、预后之间的关系。然后进一步在细胞水平验证TRPC1对食管癌细胞生长、侵袭等功能的影响。最后探讨干扰TRPC1后,检测其中某些重要通路蛋白的变化,从而更清楚的阐述TRPC1在促进食管癌细胞增殖中的机制。材料与方法：1.主要的实验材料1.1组织标本收集中山大学附属肿瘤医院自2002年3月至2009年8月共166例食管鳞癌患者,其中有45对食管鳞癌和及其匹配的正常组织。男性121人,女性45人,中位年龄59岁。所有病人术前未进行抗肿瘤治疗,且均经病理组织学诊断为食管鳞癌。1.2实验试剂鼠抗人的TRPC1单克隆抗体,兔抗人的pAKT和pERK单克隆抗体,RIPA裂解液,SDS-PAGE凝胶配置试剂盒,Trizol,逆转录试剂盒及SYBR Green Ⅰ荧光定量试剂盒,胎牛血清,high-glucose DMEM,转染试剂lipo2000,质粒提取试剂盒,MTT, Matrigel基底胶,细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒等。1.3实验仪器恒温孵箱,流式细胞仪,电泳槽,PCR扩增仪,冰箱,光学显微镜,高速离心机,电子天平秤,培养皿,吸管,微量移液器,试管,EP管,冻存管等。2.细胞培养选取人食管鳞癌细胞KYSE30进行实验,培养条件为10%胎牛血清+高糖的DMEM,37℃,5%CO2培养箱中孵育。3.实验流程3.1TRPC1在食管癌中的表达采用实时定量PCR和Western Blot的方法比较食管癌组织与其匹配的正常组织,及食管鳞癌细胞株与永生化食管上皮细胞中TRPC1的表达差异。采用ROC曲线的方法获取TRPC1判断患者预后情况的最佳分界点,并依据此点将患者分别分成高低表达两组。3.2TRPC1蛋白表达与食管癌病人临床病理特征及预后之间的关系收集166例中山大学附属肿瘤医院食管癌病人的临床资料,按照患者的性别(男、女)、年龄(≤59、>59岁)、pT分期(≤2、>T3)、淋巴结转移(无淋巴结转移、有淋巴结转移)、分化程度(高、中、低)、病理分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)对TRPC1进行分层分析,进行TRPC1单因素和多因素生存分析,评价TRPC1是否为食管癌患者的独立预后指标。3.3干扰TRPC1对食管癌细胞增殖、侵袭等生物学功能的影响采用慢病毒转染的方法以干扰食管癌KYSE30细胞株中TRPC1的表达量,并设立空载体对照组,免疫印迹及qPCR验证稳定转染效率,并进行细胞生物学功能实验,包括MTT比色法及细胞克隆形成实验检测细胞生长增殖情况；Transwell实验检测细胞侵袭能力；流式细胞仪检测细胞周期情况,以评价下调TRPC1表达量对食管鳞癌细胞的生物学功能的影响。且选择干扰组及对照组两种细胞,分别注射到雌性裸鼠的大腿根部,观察在体内水平下,TRPC1对食管癌细胞增殖的影响。3.4干扰TRPC1抑制食管鳞癌细胞增殖的机制探讨采用慢病毒转染法建立了食管鳞癌细胞株KYSE30干扰组,激光共聚焦实验方法检测细胞内Ca2+的差别,通过Western blot检测来检测下调TRPC1表达量后,通路上相关蛋白的变化,从而抑制细胞增殖。4.统计学处理采用SPSS13.0统计软件分析。TRPC1在食管鳞癌和正常组织之间、两者与患者临床病理参数之间的比较采用Pearson χ2检验；TRPC1表达临界值是采用ROC曲线方法以获取,单因素生存分析采用Kaplan-Meier法,多因素生存分析采用Cox风险比例回归模型法。MTT细胞增殖检测、裸鼠肿瘤体积观察,均以平均数±标准差的形式表示(实验重复三次,至少两次实验是在同一实验条件下完成)采用析因分析方差分析比较各组间差异；对比干扰前后食管鳞癌细胞株KYSE30的的TRPC1的研究蛋白的变化,细胞克隆形成实验、流式检测细胞周期实验、Transwell侵袭实验等选择单因素方差分析。P<0.05,表示有统计学意义。结果：1.TRPC1蛋白在食管鳞癌组织及细胞株中的表达情况入选的45例病例中,对比正常组织,71.1%(32/45)肿瘤组织TRPCl mRNA高表达,肿瘤组织相对表达量(5.1034±7.38188)高于正常组织(2.4999±3.43938,P=0.019)。同时与永生化食管上皮细胞(NE1)相比较,该课题收集的所有食管鳞癌细胞(KYSE30、 KYSE140、 KYSE180、EC109等)中TRPC1的表达量均较高。同时取了8例病人的标本,通过Western blotting从蛋白水平上验证,得到了与mRNA水平一致的结论。2. TRPC1蛋白表达与食管鳞癌患者临床病理特征及预后的关系通过ROC曲线,TRPC1mRNA表达量临界值为1.427(P=0.0088),并以此值为分界点,将食管鳞癌患者分为TRPC1高表达者及低表达者。TRPC1蛋白表达同食管鳞癌患者的性别(P=0.537)、淋巴结转移(P=0.553)、分化程度(P=0.455)无明显相关,而与年龄(P=0.007)、pT分期(P<0.001)及TNM分期(P=0.030)相关。Kaplan-Meier生存分析发现,TRPCl mRNA低表达(TRPC<1.427,n=71)中位生存期明显长于高表达者(TRPC1>1.427,n=95)(78.338M VS51.645M, P=0.002)。Cox多因素回归分析则表明,TRPC1(P=0.001)及TNM分期(P<0.001)均是食管鳞癌患者的独立预后预测因子。3.TRPC1抑制食管鳞癌细胞增殖、侵袭食管鳞癌细胞株KYSE30分别转染了TRPC1-shRNA1,2,3,4和TRPC1-negative,随后持续使用2ug/ml的嘌呤霉素进行筛选,最终成功构建TRPC1干扰组和空白载体的稳定细胞株,干扰组细胞株分别命名为KYSE30-3.KYSE30-4,而空白载体组细胞株命名为KYSE30-S。通过qPCR和Western blot进行检测,结果表明,干扰组细胞KYSE30-3和KYSE30-4的TRPC1表达水平,较对照组细胞KYSE30-S明显降低(P<0.05)。通过MTT实验和细胞克隆形成实验,检测各组细胞在体外的增殖情况。干扰组KYSE3O-3、KYSE30-4和对照组KYSE30-S,在不同时间点的增殖速度有显著差异(P<0.001)。此外,细胞克隆形成实验数据表明,与空白对照组KYSE30-S细胞相比较,干扰组KYSE30-3、KYSE30-4的细胞增殖能力和细胞群体依赖性明显降低(P<0.001)。为了更清楚地阐述下调TRPC1对食管鳞癌细胞增殖能力的影响,采用细胞周期检测。数据表明,相比TRPC1对照组(KYSE30-S),TRPC1干扰组细胞(KYSE30-3. KYSE30-4)的细胞周期阻滞在G1期,而S期减少(P<0.001),从而抑制细胞增殖能力。此外还进行了细胞侵袭实验,以检测下调TPRC1表达,对食管鳞癌细胞KYSE30侵袭能力的影响程度。实验结果表明了,较TRPC1对照组(KYSE30-S), TRPC1干扰组细胞(KYSE30-3、KYSE30-4)的侵袭能力明显降低(P<0.001)。裸鼠成瘤实验以检测,下调TRPC1表达对食管鳞癌细胞体内成瘤能力的影响。选取6只雌性裸鼠,分别同时在左右两侧的大腿根部,于皮下注射KYSE30-S. KYSE30-4细胞,连续观察21天后,实验数据表明,干扰组细胞KYSE30-4皮下注射组裸鼠皮下肿瘤体积明显小于对照组KYSE30-S (P<0.001)。21天后处死全部裸鼠,并将肿瘤称重,KYSE30-4和KYSE30-S的肿瘤平均重量分别为39.4±25.10mg及139±30.01mg; KYSE30-4组的瘤重明显小于KYSE30-S组,且有显著统计学意义(P=0.006)。4. TRPC1调节p-CREB及其信号传导通路蛋白的表达慢病毒转染使食管鳞癌细胞KYSE30持续低表达TRPC1, p-CREB蛋白的表达量较空载体对照组明显增加,抑制细胞增殖能力。除此之外,且p-CREB变化,可能依赖于PI3K/Akt和Erk1/2通路,与这两个通路蛋白呈正相关关系。结论：(1) TRPC1在食管鳞癌中表达较癌旁组织高,TRPC1蛋白表达同食管鳞癌患者的性别、淋巴结转移、分化程度无明显相关,而与年龄、pT分期及TNM分期相关。TRPC1表达高者,其预后差,提示TRPC1可作为食管鳞癌患者生存时间的独立预测因子。(2)体外细胞功能实验表明,TRPC1可促进食管鳞癌细胞增殖、迁移等恶性生物学行为；同时裸鼠皮下成瘤模型实验也提示,TRPC1促进食管鳞癌细胞的增殖。(3)降低TRPC1表达后,p-CREB增加,抑制细胞增殖能力；且p-CREB变化,可能依赖于PI3K/Akt和Erk1/2通路,与这两个通路蛋白呈正相关关系。