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目的:糖尿病病理状态可诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)从收缩表型转化为合成表型,使其增殖和迁移能力显著增强,从而导致糖尿病血管病变。该过程中,VSMC的表型转化是糖尿病发生过度增殖和迁移的前提和基础。二甲双胍(metformin)作为目前广泛用于治疗II型糖尿病(DM2)的口服降糖药,不仅可以有效地控制血糖,还能不依赖其降糖效应独立通过腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)等信号通路并且影响VSMC增殖、迁移、表型及凋亡等,从而发挥心血管保护作用,然而具体的分子调控机制尚不清楚。研究揭示,二甲双胍激活AMPK信号通路能够诱导多种血管细胞miRNA异常表达,并且本研究组前期研究发现二甲双胍可诱导多个平滑肌表型转化相关miRNA显著上调或下调表达,其中miR-1水平变化倍数阈值最高,呈显著上调趋势。部分研究显示miR-1功能与VSMC表型转及增殖、迁移等密切相关。基于此,本研究拟调查metformin激活AMPK信号通路对血管平滑肌miR-1及其靶基因CCND1以及相关上下游信号通路的影响,进一步查明metformin调节miR-1对血管平滑肌细胞增殖、迁移、凋亡以及表型转化的影响,从而探讨二甲双胍通过miRNA分子网络调控途径发挥心血管保护作用的具体分子调控机制,可为当前糖尿病心血管类疾病的防治提供一定理论依据。方法:1.q RT-PCR检测二甲双胍对VSMC表型转化miRNA-1表达的影响;2.“CCK-8法”和“细胞划痕实验”分别检测二甲双胍联合体外转染miR-1模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitors)及相应阴性对照(negative control,NC)对人主动脉平滑肌细(Human aortic smooth muscle cells,HASMCs)增殖和迁移能力的影响;3.“Annexin V-FITC/PI双染色法”分别检测单独二甲双胍、单独转染miR-1 mimics、inhibitors、和分别的NC以及Metformin联合体外转染miR-1处理HASMCs后对其凋亡的能力影响;4.生物信息学软件预测miR-1潜在的靶基因,并进一步应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1对其靶标CCND1m RNA的结合位点和靶向调控作用;5.q RT-PCR和Western blotting检测HASMCs中miR-1对靶标CCND1 m RNA和蛋白以及表型转化标志蛋白表达的影响;6.Western blotting检测二甲双胍激活AMPK对下游TGF-β1介导的Akt-,ERK-信号传导通路以及HASMCs表型转化标志蛋白水平的影响;结果:1.二甲双胍呈剂量和时间依赖性上调HASMCs miR-1表达,20 m M二甲双胍处理24h表达差异变化最显著。2.二甲双胍处理明显抑制HASMCs的增殖和迁移能力;下调HASMCs中miR-1表达后二甲双胍对HASMCs增殖和迁移能力的抑制效应明显减弱;相反的,上调miR-1后,二甲双胍对HASMC增殖和迁移能力的抑制效应明显增强。3.靶基因生物信息学预测结果显示miR-1与CCND1 m RNA 3’-UTR存在靶向结合位点;进一步双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-1直接靶向调控CCND1。4.q RT-PCR和Western blotting检测结果显示,转染mimic上调miR-1表达促进合成型CCND1、PCNA蛋白水平显著降低,相反收缩型标志物SMA、SMMHC蛋白水平则明显升高。进一步发现下调HASMCs中miR-1表达后inhibitor转染导致HASMCs中miR-1表达下调可使其靶标以及合成型标志物CCND1、PCNA蛋白水平显著增加,相反收缩型标志物SMA、SMMHC蛋白水平则明显降低;5.二甲双胍激活并诱导AMPK磷酸化,TGF-β1蛋白水平显著降低,引起下游Akt-、ERK1/2-磷酸化水平显著减少。二甲双胍处理导致合成表型标志蛋白CCND1、PCNA水平显著下调,收缩表型标志蛋白SMA、SMMHC水平则明显上调。6.二甲双胍联合miR-1 mimic处理显著增强HASMCs收缩型标志蛋白SMA、SMMHC表达,抑制合成型标志蛋白PCNA、CCND1水平;相反,二甲双胍联合miR-1 inhibitor处理能够有效阻止二甲双胍对HASMCs表型转化标志物蛋白水平的调节作用。7.Annexin V-FITC/PI双染色法结果显示,二甲双胍促进HASMCs凋亡。上调HASMCs中miR-1表达(转染mimic)后,可显著增加HASMCs凋亡效率,相反地,Metformin联合miR-1 inhibitor处理后抑制miR-1表达,将明显降低HASMCs凋亡效率。结论:1.二甲双胍处理呈剂量和时间依赖性上调HASMCs中miR-1表达。2.miR-1可与CCND1 3’-UTR区域直接结合从而靶向调控CCND1表达。3.体外干预miR-1表达能够有效调节HASMCs表型转化标志物如SMA、SMMHC、CCND1、PCNA等蛋白水平变化。4.二甲双胍通过激活AMPK,降低TGF-β1表达,减少Akt-,ERK-信号通路。二甲双胍诱导miR-1表达上调,导致其靶标及及合成型标志物CCND1、PCNA蛋白水平显著降低,收缩型标志物SMA、SMMHC蛋白水平明显增加。5.二甲双胍明显抑制HASMCs增殖、迁移能力并促进其凋亡,体外过表达或抑制miR-1表达可以相应的增强或阻遏二甲双胍对HASMCs增殖、迁移和凋亡能力的作用效果以及对HASMCs表型转化标志蛋白水平的调节作用。