论文部分内容阅读
目的建立准确、灵敏、操作简便的高效液相色谱—电化学检测法(HPLC-ECD),测定大鼠脑组织中单胺类神经递质含量；考察预知子提取物(FAE)对大鼠前额皮层、海马、纹状体中去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)、五羟色胺(5-HT)含量的影响,探索FAE可能的抗抑郁机制。建立检测马兜铃酸A的高效液相色谱法(HPLC-DAD),检测FAE与常春藤皂苷元(Hederagenin)中,是否含有肾毒性残留成分马兜铃酸A,进一步完善质量控制标准,以确保FAE和常春藤皂苷元的用药安全性。方法1、大鼠脑组织中单胺类神经递质测定方法的建立：采用HPLC-ECD法测定大鼠脑组织中NA、DA、5-HT的递质含量,以3,4-二羟基苄胺(DHBA)为内标。采用的色谱条件为,色谱柱：Dikma Diamonsil-C18(5μm,4.6×250mm)；流动相：A-B(90:10),A为磷酸二氢钠水溶液(含25.0mmol/L NaH2PO4,1.7mmol/L辛烷磺酸钠,0.7mmol/L三乙胺,0.025mmol/LEDTA-2Na,pH=3.0),B为乙腈；流速：1.0mL/min；柱温：32℃；检测电势：E1=-150V,E2=220V,进样量20μL。2、FAE对大鼠脑组织中单胺类神经递质含量的影响：(1)急性给药实验：将体重范围在200-220g的雄性SD大鼠,随机分为4组,即溶剂对照(0.5%羧甲基纤维素钠)组、草酸-S-西酞普兰(ESC)10mg/kg阳性对照组、FAE50mg/kg给药组和FAE25mg/kg给药组。各组动物均灌胃-次,灌胃体积为10mL/kg；大鼠单次给药后分别于1h、2h、3h、5h四个时间点取出脑组织,冰上操作分离不同脑区,收集样品待测。(2)亚急性给药实验：将体重范围在200-220g的雄性SD大鼠,随机分为4组(同急性给药实验),除溶剂对照组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠外,其余各组灌胃给予相应药物处理；各组动物每日灌胃1次,每次灌胃体积为10mL/kg,连续给药21d,并于末次给药2h后收集样品。(3)样品处理：大鼠断头处死,迅速取出全脑,于冰上快速分离出前额皮层、海马、纹状体部位,置冻存管存于液氮。取冻存的脑组织,称重后置于玻璃匀浆器,按10mL/kg的比例加入预冷含内标DHBA的高氯酸工作液,于冰浴下快速匀浆2min。将研磨好的匀浆液移入棕色离心管,于4℃条件下14000×g离心20min后取上清液,上清液再用0.22μm滤器过滤后上机检测。(4)数据处理：各部位的单胺类神经递质含量,均换算成湿组织浓度(ng/g),并用SPSS13.0进行统计学分析(ONE-WAY ANOVA),结果用GraphPad Prism5作图。3、马兜铃酸A检测方法的建立：采用HPLC-DAD法,样品用Dikma Diamonsil-C18柱(5μm,4.6×250mm)进行分离；以乙腈-水-冰醋酸(80：20：0.04)作为流动相；流速1.0mL/min,柱温为32℃,进样量为20μL；检测波长分别为210nm与250nm。结果1、测定大鼠脑组织中单胺类神经递质的HPLC-ECD法：样品中的内源性物质不干扰检测,各色谱峰均有效分离。NA、DA、5-HT的定量下限依次为12.0ng/mL、9.8ng/mL、20.8ng/mL,分别在0.0240-0.2400,0.0196-0.1960,0.0226-0.2260μg/mL范围内线性关系良好(R2≥0.9996)；平均回收率分别为NA：84.41%-102.77%,DA：87.52%～104.61%,5-HT：83.74%-101.66%,RSD均小于15%；日内精密度均在3.05%-5.81%范围内,日间精密度在4.98%～7.59%之间。2、急性给药处理后,大鼠脑组织各部位的单胺类神经递质变化结果：(1)在前额皮层与海马部位,与溶剂对照组比较,NA在急性给予25mg/klg和50mg/kg FAE3h后显著升高；5-HT在急性给予10mg/kg ESC2h后和给予50mg/kg FAE3h后有所升高；DA在给予各种处理后均末观察到明显的变化。(NA-溶剂对照组vs25mg/kg和50mg/kg FAE组,前额皮层：360.645±13.619ng/g vs436.582±5.785ng/g,450.396±12.506ng/g；海马：351.405±14.206ng/g vs394.362±±8.041ng/g,410.530±10.477ng/g。)(5-HT-溶剂对照组vs10mg/kg ESC组,前额皮层：934.494±25.054ng/g vs1034.001±29.773ng/g；海马：592.150±11.557ng/g vs645.036±12.545ng/g。溶剂对照组vs50mg/kg FAE组,前额皮层：939.202±27.075ng/g vs1024.500±39.169ng/g；海马：593.729±22.887ng/g vs645.012±±3.969ng/g。)(2)在纹状体部位,与溶剂对照组比较,DA在给予25mg/kg和50mg/kg FAE3h后升高,而NA和5-HT则在给予各种处理后均末观察到明显变化。(DA-溶剂对照组vs25mg/kg和50mg/kg FAE组,7316.341±463.518ng/gvs9057.434±604.403ng/g,9205.288±832.326ng/g。)3、亚急性给药处理后,大鼠脑组织各部位的单胺类神经递质变化结果：(1)在前额皮层与海马部位,与溶剂对照组比较,NA在连续给予25mg/kg和50mg/kg FAE21d后显著升高；5-HT在连续给予10mg/kg ESC、25mg/kg和50mg/kg FAE21d后显著升高；但DA在连续给予各种处理21d后末观察到明显变化。(NA-溶剂对照组vs25mg/kg和50mg/kg FAE组,前额皮层：302.295±±7.036ng/g vs351.930±3.271ng/g,382.463±7.208ng/g；海马：279.287±±4.142ng/g vs302.511±6.426ng/g,394.189±4.307ng/g。)(5-HT-溶剂对照组vs10mg/kg ESC组,25mg/kg和50mg/kg FAE组,前额皮层：826.005±±9.528ng/g vs1128.418±±17.316ng/g,1022.831±19.777ng/g,1012.098±±15.274ng/g；海马：549.010±2.723ng/g vs780.082±±4.558ng/g,703.941±3.976ng/g,758.575±±2.915ng/g。)(2)在纹状体部位,与溶剂对照组比较,DA在连续给予25mg/kg和50mg/kg FAE21d后显著升高。(DA-溶剂对照组vs25mg/kg和50mg/kg FAE组,7029.182±492.037ng/g vs9500.078±424.739ng/g,9706.304±366.826ng/g。)4、测定马兜铃酸A的HPLC-DAD法：马兜铃酸A和药用主成分常春藤皂苷元能有效分离；且在0.24～2.40μg/mL范围内线性关系良好(R2=0.9993),检出限为40ng/mL；方法学考察结果显示,马兜铃酸A的日内精密度为1.24%～5.28%,日间精密度在4.11%～7.28%之间,平均回收率85.96%～96.23%,RSD≤2.96%。采用该检测方法,对本实验中的常春藤皂苷元样品和FAE进行检测,结果均末检出马兜铃酸A。结论建立的大鼠脑组织中单胺类神经递质HPLC-ECD检测方法,具有准确、灵敏、操作简便等特点,经方法学考察,适用于大鼠脑组织中单胺类神经递质的定量检测。FAE能显著提高前额皮层、海马、纹状体部位的单胺类神经递质NA、DA、5-HT的含量,提示FAE的抗抑郁作用与单胺类神经递质含量水平的变化密切相关。建立马兜铃酸A的HPLC-DAD检测方法,具有快速、简单的特点,可用于马兜铃酸A的检测；所检测的样品中均末检测出马兜铃酸A,表明该实验所采用的FAE与常春藤皂苷元安全可靠。