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宫颈癌是女性常见恶性肿瘤，放疗是其主要治疗手段之一，临床上约有80%子宫颈癌患者曾接受放疗，而其中30%~50%的晚期患者出现了放疗抵抗。因此，提高放射敏感性对晚期宫颈癌患者十分重要。靶向放射增敏剂将极大地提高肿瘤对放疗的敏感性，是改善放疗疗效的有效途径。但目前尚无理想的靶向放射增敏剂应用于临床。
纳米科技的发展为研发新的靶向放射增敏剂提供了大量的理论依据及技术支持。金纳米颗粒(Gold nanoparticles, AuNPs or GNPs)具有独特理化性能、强光电吸收、表面等离子共振等效应，易制备且粒径与形态可控，与肿瘤组织具有高渗透性和滞留效应，同时易于修饰、生物相容性好等优点，是一种比较理想的放射增敏剂。
本项目拟用体内噬菌体展示技术筛选的宫颈癌特异性结合肽(cervical cancer specific binding peptides, CSPs)修饰AuNPs，以实现其对宫颈癌的主动靶向目的，增强其肿瘤放射增敏疗效，降低毒副作用，为宫颈癌的靶向放射增敏治疗提供崭新思路和有益探索。
本实验分三部分研发这种新型宫颈癌靶向放射增敏剂，并探讨其对宫颈癌细胞的靶向性及体外放射增敏作用。
第一部分宫颈癌特异性结合肽的筛选
目的：利用体内噬菌体展示技术筛选对宫颈癌有特异靶向结合能力的CSPs。
方法：将噬菌体展示环七肽库或十二肽库经尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内，经3~4轮体内亲和筛选，以肿瘤组织的噬菌体回收率和免疫组化染色，分析噬菌体在肿瘤组织中的富集情况。细胞ELISA实验鉴定末轮筛选所得噬菌体单克隆对宫颈癌细胞的亲和力。M13噬菌体单链DNA快速提取试剂盒提取高亲和力噬菌体单克隆DNA、送检测序、分析推导出CSPs序列，并进行多肽基本理化性质及同源性分析。体内回输验证CSPs噬菌体对宫颈癌裸鼠移植瘤的特异靶向能力。免疫荧光检测CSPs对人宫颈癌细胞和组织的特异性结合能力。
结果：(1)噬菌体展示环七肽库或十二肽库分别经人宫颈癌细胞(SiHa、C-33A及ME-180细胞)荷瘤裸鼠体内筛选3~4轮后，噬菌体在肿瘤组织中得到了明显富集，其回收率明显增加(P＜0.05vs.Round1)，而相应对照组织(心、肝、肾及脑)中并无此变化。免疫组化染色也证实了这一点。(2)细胞ELISA检测结果显示每组末轮筛选所得噬菌体单克隆对宫颈癌细胞都有较好的特异性结合能力。(3)先后送检162个【SiHa(12p):48,SiHa(7p):10;C-33A(12p):40,C-33A(7p):35;ME-180(12p):17,ME-180(7p):12】末轮筛选后提取的噬菌体单克隆DNA样本测序，结果获得5个重复率较高的短肽序列GDALFSVPLEVY、TLHQPPSSANWI、FTPGGNTYAGQP、SIDDQRDVAEFA及KQNLAEG，分别命名为CSP-GD、CSP-TL、CSP-FT、CSP-SI、CSP-KQ。(4)体内回输筛选所得CSPs噬菌体单克隆，CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI及CSP-KQ噬菌体在肿瘤组织中得到了明显富集，与对照组织(肝、肾)相比，其回收率明显增加(P＜0.05)，而CSP-TL噬菌体在肿瘤组织中未得到明显富集，与对照组织相比，其回收率无明显增加(P＞0.05)。说明CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI及CSP-KQ噬菌体单克隆可体内特异性靶向宫颈癌裸鼠移植瘤。(5)细胞免疫荧光染色结果显示CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI和CSP-KQ对宫颈癌细胞具有特异性靶向能力，且结合位点主要位于细胞膜和细胞质。(6)组织免疫荧光染色结果显示CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI和CSP-KQ对人宫颈癌组织均有一定的抗原特异性，尤其是CSP-GD和CSP-KQ。
结论：筛选了四条CSPs(12肽CSP-GD、CSP-FT及CSP-SI，7肽CSP-KQ)；CSPs对人宫颈癌细胞有特异靶向性，对人宫颈癌组织也有一定的抗原特异性，尤其是CSP-GD和CSP-KQ。
第二部分金纳米颗粒靶向载体体系AuNPs-PEG-(CSP-GD)的制备及表征
目的：研制一种具有宫颈癌靶向性的金纳米颗粒靶向载体体系AuNPs-PEG-(CSP-GD)，用于宫颈癌靶向放射增敏研究。
方法：以四氯金酸为原材料，在特定条件下，用柠檬酸钠还原法制备AuNPs，并先后用聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)和CSP-GD修饰，相继合成AuNPs-PEG、AuNPs-PEG-(CSP-GD)；并对AuNPs-PEG-(CSP-GD)制备条件进行优化。用透射电镜(TEM)、马尔文激光粒度仪、X射线光电子能谱仪(XPS)、紫外可见光光谱仪(UV-Vis)、荧光分光光度仪等对其进行表征，电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测溶液金浓度、MicroBCA法检测CSP-GD偶联量。
结果：(1)成功制备尺寸均匀、单分散性好的AuNPs，粒径14.48±1.17nm。(2)AuNPs-PEG-(CSP-GD)制备的优化条件为：反应中金元素质量0.1mg，MES溶液调节的反应体系pH值6.5，反应温度16℃，反应时长8h，AuNPs-PEG与CSP-GD的反应质量比为1:20。(3)在优化条件下制备的AuNPs-PEG-(CSP-GD)单分散性好、稳定，粒径65.91±1.44nm，金浓度为9.966±0.013μg/mL，CSP-GD偶联量为3.22±0.11μg/mL。XPS、UV-Vis及荧光光谱表征结果均显示CSP-GD成功修饰至AuNPs-PEG表面。
结论：成功制备金纳米颗粒靶向载体体系AuNPs-PEG-(CSP-GD)。
第三部分AuNPs-PEG-(CSP-GD)的靶向性及体外放射增敏研究
目的：验证AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞的体内外靶向性，并进一步探讨其对宫颈癌细胞的体外放射增敏作用。
方法：细胞免疫荧光、流式细胞仪及小动物活体成像检测分析AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞的体内外靶向能力；CCK-8实验检测CSP-GD及AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞SiHa和C-33A的细胞增殖毒性；在辐照条件下，细胞克隆形成实验和流式细胞术检测AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞的放射增敏作用。
结果：(1)细胞免疫荧光结果显示SiHa或C-33A细胞分别与香豆素6标记的不同金纳米颗粒(Au质量终浓度为10μg/mL)共同孵育2、6、12h后，两株癌细胞对AuNPs-PEG-(CSP-GD)的摄取均明显多于AuNPs-PEG和AuNPs(P＜0.05)。流式细胞仪检测结果与此一致。(2)小动物活体成像结果显示AuNPs-PEG-(CSP-GD)较明显靶向富集于肿瘤组织(P＜0.05)，表明AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌组织具有较好的体内靶向性。(3 )CCK-8实验结果显示CSP-GD对宫颈癌SiHa、C-33A细胞均无明显生长抑制作用(P＞0.05)；低浓度AuNPs、AuNPs-PEG及AuNPs-PEG-(CSP-GD)对SiHa、C-33A细胞也均无明显毒性作用(P＞0.05)。(4)细胞克隆形成实验结果显示当AuNPs-PEG浓度分别为5μg/mL、10μg/mL时，其SERD0分别为1.05、1.10；当AuNPs-PEG-(CSP-GD)浓度分别是5μg/mL、10μg/mL时，其SERD0分别达到1.49、1.57，且AuNPs-PEG-(CSP-GD)增敏作用明显优于AuNPs-PEG(P＜0.05)。(5)流式细胞仪检测结果显示，相比于单纯辐照和单纯金纳米颗粒组，金纳米颗粒+辐射联合组诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的能力最强，且AuNPs-PEG-(CSP-GD)+Radiation联合组(30.43±3.32%)明显强于AuNPs-PEG+Radiation联合组(21.24±3.95%)(P＜0.05)。
结论：AuNPs-PEG-(CSP-GD)对人宫颈癌细胞具有较好的体内外靶向性，及体外放射增敏作用。
纳米科技的发展为研发新的靶向放射增敏剂提供了大量的理论依据及技术支持。金纳米颗粒(Gold nanoparticles, AuNPs or GNPs)具有独特理化性能、强光电吸收、表面等离子共振等效应，易制备且粒径与形态可控，与肿瘤组织具有高渗透性和滞留效应，同时易于修饰、生物相容性好等优点，是一种比较理想的放射增敏剂。
本项目拟用体内噬菌体展示技术筛选的宫颈癌特异性结合肽(cervical cancer specific binding peptides, CSPs)修饰AuNPs，以实现其对宫颈癌的主动靶向目的，增强其肿瘤放射增敏疗效，降低毒副作用，为宫颈癌的靶向放射增敏治疗提供崭新思路和有益探索。
本实验分三部分研发这种新型宫颈癌靶向放射增敏剂，并探讨其对宫颈癌细胞的靶向性及体外放射增敏作用。
第一部分宫颈癌特异性结合肽的筛选
目的：利用体内噬菌体展示技术筛选对宫颈癌有特异靶向结合能力的CSPs。
方法：将噬菌体展示环七肽库或十二肽库经尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内，经3~4轮体内亲和筛选，以肿瘤组织的噬菌体回收率和免疫组化染色，分析噬菌体在肿瘤组织中的富集情况。细胞ELISA实验鉴定末轮筛选所得噬菌体单克隆对宫颈癌细胞的亲和力。M13噬菌体单链DNA快速提取试剂盒提取高亲和力噬菌体单克隆DNA、送检测序、分析推导出CSPs序列，并进行多肽基本理化性质及同源性分析。体内回输验证CSPs噬菌体对宫颈癌裸鼠移植瘤的特异靶向能力。免疫荧光检测CSPs对人宫颈癌细胞和组织的特异性结合能力。
结果：(1)噬菌体展示环七肽库或十二肽库分别经人宫颈癌细胞(SiHa、C-33A及ME-180细胞)荷瘤裸鼠体内筛选3~4轮后，噬菌体在肿瘤组织中得到了明显富集，其回收率明显增加(P＜0.05vs.Round1)，而相应对照组织(心、肝、肾及脑)中并无此变化。免疫组化染色也证实了这一点。(2)细胞ELISA检测结果显示每组末轮筛选所得噬菌体单克隆对宫颈癌细胞都有较好的特异性结合能力。(3)先后送检162个【SiHa(12p):48,SiHa(7p):10;C-33A(12p):40,C-33A(7p):35;ME-180(12p):17,ME-180(7p):12】末轮筛选后提取的噬菌体单克隆DNA样本测序，结果获得5个重复率较高的短肽序列GDALFSVPLEVY、TLHQPPSSANWI、FTPGGNTYAGQP、SIDDQRDVAEFA及KQNLAEG，分别命名为CSP-GD、CSP-TL、CSP-FT、CSP-SI、CSP-KQ。(4)体内回输筛选所得CSPs噬菌体单克隆，CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI及CSP-KQ噬菌体在肿瘤组织中得到了明显富集，与对照组织(肝、肾)相比，其回收率明显增加(P＜0.05)，而CSP-TL噬菌体在肿瘤组织中未得到明显富集，与对照组织相比，其回收率无明显增加(P＞0.05)。说明CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI及CSP-KQ噬菌体单克隆可体内特异性靶向宫颈癌裸鼠移植瘤。(5)细胞免疫荧光染色结果显示CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI和CSP-KQ对宫颈癌细胞具有特异性靶向能力，且结合位点主要位于细胞膜和细胞质。(6)组织免疫荧光染色结果显示CSP-GD、CSP-FT、CSP-SI和CSP-KQ对人宫颈癌组织均有一定的抗原特异性，尤其是CSP-GD和CSP-KQ。
结论：筛选了四条CSPs(12肽CSP-GD、CSP-FT及CSP-SI，7肽CSP-KQ)；CSPs对人宫颈癌细胞有特异靶向性，对人宫颈癌组织也有一定的抗原特异性，尤其是CSP-GD和CSP-KQ。
第二部分金纳米颗粒靶向载体体系AuNPs-PEG-(CSP-GD)的制备及表征
目的：研制一种具有宫颈癌靶向性的金纳米颗粒靶向载体体系AuNPs-PEG-(CSP-GD)，用于宫颈癌靶向放射增敏研究。
方法：以四氯金酸为原材料，在特定条件下，用柠檬酸钠还原法制备AuNPs，并先后用聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)和CSP-GD修饰，相继合成AuNPs-PEG、AuNPs-PEG-(CSP-GD)；并对AuNPs-PEG-(CSP-GD)制备条件进行优化。用透射电镜(TEM)、马尔文激光粒度仪、X射线光电子能谱仪(XPS)、紫外可见光光谱仪(UV-Vis)、荧光分光光度仪等对其进行表征，电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测溶液金浓度、MicroBCA法检测CSP-GD偶联量。
结果：(1)成功制备尺寸均匀、单分散性好的AuNPs，粒径14.48±1.17nm。(2)AuNPs-PEG-(CSP-GD)制备的优化条件为：反应中金元素质量0.1mg，MES溶液调节的反应体系pH值6.5，反应温度16℃，反应时长8h，AuNPs-PEG与CSP-GD的反应质量比为1:20。(3)在优化条件下制备的AuNPs-PEG-(CSP-GD)单分散性好、稳定，粒径65.91±1.44nm，金浓度为9.966±0.013μg/mL，CSP-GD偶联量为3.22±0.11μg/mL。XPS、UV-Vis及荧光光谱表征结果均显示CSP-GD成功修饰至AuNPs-PEG表面。
结论：成功制备金纳米颗粒靶向载体体系AuNPs-PEG-(CSP-GD)。
第三部分AuNPs-PEG-(CSP-GD)的靶向性及体外放射增敏研究
目的：验证AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞的体内外靶向性，并进一步探讨其对宫颈癌细胞的体外放射增敏作用。
方法：细胞免疫荧光、流式细胞仪及小动物活体成像检测分析AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞的体内外靶向能力；CCK-8实验检测CSP-GD及AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞SiHa和C-33A的细胞增殖毒性；在辐照条件下，细胞克隆形成实验和流式细胞术检测AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌细胞的放射增敏作用。
结果：(1)细胞免疫荧光结果显示SiHa或C-33A细胞分别与香豆素6标记的不同金纳米颗粒(Au质量终浓度为10μg/mL)共同孵育2、6、12h后，两株癌细胞对AuNPs-PEG-(CSP-GD)的摄取均明显多于AuNPs-PEG和AuNPs(P＜0.05)。流式细胞仪检测结果与此一致。(2)小动物活体成像结果显示AuNPs-PEG-(CSP-GD)较明显靶向富集于肿瘤组织(P＜0.05)，表明AuNPs-PEG-(CSP-GD)对宫颈癌组织具有较好的体内靶向性。(3 )CCK-8实验结果显示CSP-GD对宫颈癌SiHa、C-33A细胞均无明显生长抑制作用(P＞0.05)；低浓度AuNPs、AuNPs-PEG及AuNPs-PEG-(CSP-GD)对SiHa、C-33A细胞也均无明显毒性作用(P＞0.05)。(4)细胞克隆形成实验结果显示当AuNPs-PEG浓度分别为5μg/mL、10μg/mL时，其SERD0分别为1.05、1.10；当AuNPs-PEG-(CSP-GD)浓度分别是5μg/mL、10μg/mL时，其SERD0分别达到1.49、1.57，且AuNPs-PEG-(CSP-GD)增敏作用明显优于AuNPs-PEG(P＜0.05)。(5)流式细胞仪检测结果显示，相比于单纯辐照和单纯金纳米颗粒组，金纳米颗粒+辐射联合组诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的能力最强，且AuNPs-PEG-(CSP-GD)+Radiation联合组(30.43±3.32%)明显强于AuNPs-PEG+Radiation联合组(21.24±3.95%)(P＜0.05)。
结论：AuNPs-PEG-(CSP-GD)对人宫颈癌细胞具有较好的体内外靶向性，及体外放射增敏作用。