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人组织激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin，KAL)是丝氨酸蛋白酶抑制剂中的一种，近年来发现血清中KAL浓度与高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平有相关性，并降低心血管疾病风险，与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)密切相关，但机制不明。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1 )是一种膜转运蛋白，在高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)生成过程中发挥关键作用。本论文通过一系列临床、细胞及动物实验探讨了KAL对ABCA1表达与As的影响及机制，发现Kallistatin通过miR-29c-3p/淋巴细胞转录抑制剂BTB和CNC同源类似物2(B lymphoid transcription repressor BTB and CNC homology 2，BACH2)途径促进ABCA1表达抗As，可为As防治提供新策略。
第一章冠心病患者血清中KAL水平的变化
目的：观察KAL在CHD患者与对照组血清中含量的变化，同时检测HDL-C水平，探讨KAL与As及HDL-C的相关性。
方法：选择研究对象为南华大学附属第一医院心血管内科行冠状动脉造影(coronary angiography ， CAG)以及冠状动脉血管内超声(intravenous ultrasound，IVUS)检査的401例患者。采用Gensini积分系统，对每段冠状动脉血管的病变狭窄程度进行定量积分评定，无病变时为0分，最高积分为160分。Gensini积分越高，提示冠状动脉狭窄越严重，As病变也越严重。将研究对象分为共分为四组，分组如下：1、对照组(Control)：Gensini积分0分，冠状动脉无狭窄病变；2、LowGensiniScore(LGS)组：Gensini积分1~20分，冠状动脉轻度狭窄病变；3、MiddleGensiniScore(MGS)组：Gensini积分20~40分，冠状动脉中度狭窄病变；4、HighGensiniScore(HGS)组：Gensini积分40~160分，冠状动脉重度狭窄病变。收集各组血液标本，离心取得血清，使用ELISA法测定纳入对象血清KAL浓度，并检测血清HDL-C水平。确认KAL与As病变及HDL-C的相关性。
结果：结果表明，各组患者之间年龄、性别、吸烟史、高血压、BMI等一般情况无明显差异，白细胞(white blood cell，WBC)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)、血尿素(Blood urea， BUN)等检查结果也无明显差异。
分析各组KAL浓度结果显示对照组为(45.69±9.69)μg/ml，而三组CHD患者血清中KAL浓度均明显下降，LGS组：(34.91±7.72)μg/ml；MGS组：(25.36±7.06)μg/ml；HGS组：(17.90±4.35)μg/ml，可见三组CHD患者血清KAL浓度与对照组比较都有显著差异，并随着Gensini评分的升高而呈现下降的趋势。说明KAL与冠状动脉的As病变严重程度成反比，提示患者体内的KAL含量越少其As越严重。
进一步行KAL浓度与HDL-C的相关性后发现，KAL浓度与HDL-C在统计学上有正相关性(R2=0.4981，P＜0.05)。提示体内KAL含量越高的患者其HDL-C水平也越高。
小结：KAL在CHD患者血清中含量显著下降；KAL浓度与HDL-C水平呈正相关关系。
第二章KAL通过miR-29c-3p/BACH2途径调控巨噬细胞ABCA1表达及脂质蓄积
目的：观察KAL对THP-1巨噬细胞ABCA1表达和脂质蓄积的影响，阐明miR-29c-3p/BACH2途径在KAL对ABCA1表达过程中的调控作用。
方法：佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)处理THP-1单核细胞48小时，诱导分化成为THP-1巨噬细胞，继续用50μg/ml浓度的ox-LDL孵育24小时，荷脂后形成THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞。分别以不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6μmol/L)的KAL处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24小时，或者用0.8μmol/L的KAL分别处理不同时间(0、6、12、24、48小时)，收集细胞，通过荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,，qRT-PCR)及Westernblot检测ABCA1表达，利用油红O染色法检测细胞内的脂质蓄积，使用液体闪烁计数仪检测胆固醇流出，利用高效液相色谱检测泡沫细胞内的胆固醇含量。确认KAL可上调巨噬细胞ABCA1表达，促进细胞胆固醇流出。
利用JASPAR在线网站预测ABCA1启动子序列与BACH2的结合位点。采用PCR方法从THP-1基因组DNA中扩增ABCA1基因启动子片段，插入荧光素酶报告载体pGL3(pGL3-ABCA1–promoter)，将荧光素酶报告基因pGL3-ABCA1-promoter与转录因子BACH2表达质粒共转染293T细胞，使用荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性，确认ABCA1启动子区域是否存在BACH2结合位点。将BACH2转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，采用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，CHIP)技术进一步分析BACH2与ABCA1启动子的相互作用。随后将BACH2或BACH2siRNA转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过qRT-PCR及WesternBlot检测ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出，证实BACH2是否直接上调ABCA1表达，促进胆固醇流出。使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过荧光定量PCR及WesternBlot检测BACH2的表达，明确KAL对BACH2的影响。沉默BACH2的表达后，再使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过qRT-PCR及WesternBlot检测ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出，明确KAL是否通过BACH2影响ABCA1表达及胆固醇流出。
利用RNAhybrid、TargetScan等生物信息学在线网站预测miR-29c-3p与BACH23’UTR的结合位点和自由能。从THP-1巨噬细胞DNA中用PCR法扩增BACH2基因3’UTR序列，在其中插入荧光素酶报告载体pGL3(pGL3-BACH2-3’UTR)，并突变BACH2形成突变BACH2荧光素酶报告载体pGL3(pGL3-BACH2-3’UTR-m)，将pGL-3-BACH2-3’UTR或pGL3-BACH2-3’UTR-m与miR-29c-3pmimic共转染至293T细胞，使用荧光素酶检测试剂盒测定其荧光素酶活性，证实miR-29c-3p可否直接作用于BACH2。分别用miR-29c-3pmimic或anti-miR-29c-3p处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，利用WesternBlot及qRT-PCR技术检测细胞内BACH2与ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出，了解过表达或沉默miR-29c-3p对BACH2、ABCA1表达以及细胞内胆固醇流出的影响。最后使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，采用qRT-PCR检测miR-29c-3p的表达，明确KAL对miR-29c-3p水平的影响，使用miR-29c-3pmimic和KAL共孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过qRT-PCR及WesternBlot检测BACH2和ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出。明确KAL是否通过miR-29c-3p靶向沉默BACH2，促进ABCA1表达BACH2影响ABCA1表达及胆固醇流出。
结果：KAL显著上调巨噬细胞ABCA1表达，并呈浓度和时间依赖性。KAL增加ABCA1介导的胆固醇流出，并减少细胞内总胆固醇、胆固醇酯(cholesteryl ester，CE)和游离胆固醇(free cholesterol，FC)含量，抑制脂质蓄积。
生物信息学预测发现，BACH2与ABCA1启动子存在结合位点。进一步通过荧光素酶报告基因和CHIP实验证实BACH2与ABCA1启动子具有结合位点，而过表达BACH2促进ABCA1表达，增加巨噬细胞的胆固醇流出，提示BACH2可与ABCA1结合并促进其转录。KAL处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后，BACH2及ABCA1的mRNA与蛋白水平明显增加，提示KAL可促进BACH2及ABCA1的表达与结合能力。而在siBACH2预处理后，KAL对促进ABCA1表达的作用被逆转，同样细胞内胆固醇流出的促进作用也被逆转。上述结果表明，KAL通过增加BACH2，使ABCA1表达上调，细胞内胆固醇流出增加。
多个生物信息学在线网站预测发现miR-29c-3p与BACH23’UTR存在结合位点，且结合自由能低(-23.6kcal/mol)，荧光素酶报告基因等实验进一步发现miR-29c-3p可直接作用于BACH2，抑制其表达，并显著减少ABCA1。而抑制miR-29c-3p后可增加BACH2及ABCA1的mRNA和蛋白水平，促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出增加。说明miR-29c-3p可抑制BACH2及ABCA1的表达，减少胆固醇流出。使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后，发现KAL明显降低miR-29c-3p的表达。而使用KAL和miR-29c-3pmimic共孵育后，与miR-29c-3pmimic组相比较，降低的BACH2及ABCA1的mRNA和蛋白水平得到一定程度的恢复，减少的胆固醇流出情况也有一定的恢复。这些结果表明，KAL通过抑制miR-29c-3p增加BACH2、ABCA1的表达及胆固醇流出。
小结：KAL上调ABCA1表达，促进胆固醇流出，抑制巨噬细胞内脂质蓄积；KAL通过miR-29c-3p/BACH2途径增加巨噬细胞ABCA1表达。
第三章KAL对apoE-/-小鼠ABCA1及As斑块面积的影响
目的：观察KAL对apoE-/-小鼠miR-29c-3p、BACH2和ABCA1表达，血脂水平，RCT效率和As斑块面积的影响，从而在整体水平揭示KAL的抗As作用及分子机制。
方法：60只雄性apoE-/-小鼠高脂饮食喂养8周后随机分为3组：1、对照组(n=20)：腹腔内注射200μl生理盐水，每周两次；2、低剂量KAL组(n=20)：腹腔内注射KAL，每次0.5mg/kg，加入200μl生理盐水中注入，每周两次；3、高剂量KAL组(n=20)：KAL剂量为每次2mg/kg，余同低剂量组。共连续处理4周。B超检查小鼠主动脉及颈动脉斑块。酶氧化法检测血浆TG、TC、LDL-C、HDL-C含量以及肝肾功能。腹腔注射[3H]标记胆固醇的J774细胞，检测血浆、肝脏和粪便中的放射性活性，计算RCT效率。处死小鼠，分离主动脉弓，体视显微镜下观察斑块情况。取小鼠心脏和主动脉，油红O和HE染色检测小鼠主动脉窦及主动脉As斑块面积。qRT-PCR检测主动脉及腹腔巨噬细胞miR-29c-3p及BACH2、ABCA1的mRNA表达，WesternBlot和免疫组织化学检测主动脉及腹腔巨噬细胞BACH2、ABCA1蛋白表达。
结果：无论是低剂量还是高剂量的KAL均减少apoE-/-小鼠主动脉弓及主动脉窦处斑块面积，抑制主动脉壁及斑块内脂质沉积，增加斑块胶原含量。证实KAL在动物体内能抑制As病变的进展。
KAL降低apoE-/-小鼠主动脉组织中miR-29c-3p水平，升高主动脉组织及腹腔巨噬细胞中BACH2、ABCA1水平，增加血浆HDL-C水平，促进RCT。提示KAL在体内同样通过抑制miR-29c-3p表达，从而减少miR-29c-3p对BACH2的抑制，促进ABCA1的表达，增加胆固醇流出至HDL，促进RCT，最终抑制apoE-/-小鼠As病变的进展。
KAL对apoE-/-小鼠体重、肝肾功能及血浆TC、LDL-C、TG水平无明显影响。
小结：KAL上调apoE-/-小鼠ABCA1表达，升高血浆HDL-C水平，促进RCT，减轻As病变；KAL在apoE-/-小鼠中通过miR-29c-3p/BACH2途径增加ABCA1表达。
第一章冠心病患者血清中KAL水平的变化
目的：观察KAL在CHD患者与对照组血清中含量的变化，同时检测HDL-C水平，探讨KAL与As及HDL-C的相关性。
方法：选择研究对象为南华大学附属第一医院心血管内科行冠状动脉造影(coronary angiography ， CAG)以及冠状动脉血管内超声(intravenous ultrasound，IVUS)检査的401例患者。采用Gensini积分系统，对每段冠状动脉血管的病变狭窄程度进行定量积分评定，无病变时为0分，最高积分为160分。Gensini积分越高，提示冠状动脉狭窄越严重，As病变也越严重。将研究对象分为共分为四组，分组如下：1、对照组(Control)：Gensini积分0分，冠状动脉无狭窄病变；2、LowGensiniScore(LGS)组：Gensini积分1~20分，冠状动脉轻度狭窄病变；3、MiddleGensiniScore(MGS)组：Gensini积分20~40分，冠状动脉中度狭窄病变；4、HighGensiniScore(HGS)组：Gensini积分40~160分，冠状动脉重度狭窄病变。收集各组血液标本，离心取得血清，使用ELISA法测定纳入对象血清KAL浓度，并检测血清HDL-C水平。确认KAL与As病变及HDL-C的相关性。
结果：结果表明，各组患者之间年龄、性别、吸烟史、高血压、BMI等一般情况无明显差异，白细胞(white blood cell，WBC)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)、血尿素(Blood urea， BUN)等检查结果也无明显差异。
分析各组KAL浓度结果显示对照组为(45.69±9.69)μg/ml，而三组CHD患者血清中KAL浓度均明显下降，LGS组：(34.91±7.72)μg/ml；MGS组：(25.36±7.06)μg/ml；HGS组：(17.90±4.35)μg/ml，可见三组CHD患者血清KAL浓度与对照组比较都有显著差异，并随着Gensini评分的升高而呈现下降的趋势。说明KAL与冠状动脉的As病变严重程度成反比，提示患者体内的KAL含量越少其As越严重。
进一步行KAL浓度与HDL-C的相关性后发现，KAL浓度与HDL-C在统计学上有正相关性(R2=0.4981，P＜0.05)。提示体内KAL含量越高的患者其HDL-C水平也越高。
小结：KAL在CHD患者血清中含量显著下降；KAL浓度与HDL-C水平呈正相关关系。
第二章KAL通过miR-29c-3p/BACH2途径调控巨噬细胞ABCA1表达及脂质蓄积
目的：观察KAL对THP-1巨噬细胞ABCA1表达和脂质蓄积的影响，阐明miR-29c-3p/BACH2途径在KAL对ABCA1表达过程中的调控作用。
方法：佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)处理THP-1单核细胞48小时，诱导分化成为THP-1巨噬细胞，继续用50μg/ml浓度的ox-LDL孵育24小时，荷脂后形成THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞。分别以不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6μmol/L)的KAL处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24小时，或者用0.8μmol/L的KAL分别处理不同时间(0、6、12、24、48小时)，收集细胞，通过荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,，qRT-PCR)及Westernblot检测ABCA1表达，利用油红O染色法检测细胞内的脂质蓄积，使用液体闪烁计数仪检测胆固醇流出，利用高效液相色谱检测泡沫细胞内的胆固醇含量。确认KAL可上调巨噬细胞ABCA1表达，促进细胞胆固醇流出。
利用JASPAR在线网站预测ABCA1启动子序列与BACH2的结合位点。采用PCR方法从THP-1基因组DNA中扩增ABCA1基因启动子片段，插入荧光素酶报告载体pGL3(pGL3-ABCA1–promoter)，将荧光素酶报告基因pGL3-ABCA1-promoter与转录因子BACH2表达质粒共转染293T细胞，使用荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性，确认ABCA1启动子区域是否存在BACH2结合位点。将BACH2转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，采用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，CHIP)技术进一步分析BACH2与ABCA1启动子的相互作用。随后将BACH2或BACH2siRNA转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过qRT-PCR及WesternBlot检测ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出，证实BACH2是否直接上调ABCA1表达，促进胆固醇流出。使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过荧光定量PCR及WesternBlot检测BACH2的表达，明确KAL对BACH2的影响。沉默BACH2的表达后，再使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过qRT-PCR及WesternBlot检测ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出，明确KAL是否通过BACH2影响ABCA1表达及胆固醇流出。
利用RNAhybrid、TargetScan等生物信息学在线网站预测miR-29c-3p与BACH23’UTR的结合位点和自由能。从THP-1巨噬细胞DNA中用PCR法扩增BACH2基因3’UTR序列，在其中插入荧光素酶报告载体pGL3(pGL3-BACH2-3’UTR)，并突变BACH2形成突变BACH2荧光素酶报告载体pGL3(pGL3-BACH2-3’UTR-m)，将pGL-3-BACH2-3’UTR或pGL3-BACH2-3’UTR-m与miR-29c-3pmimic共转染至293T细胞，使用荧光素酶检测试剂盒测定其荧光素酶活性，证实miR-29c-3p可否直接作用于BACH2。分别用miR-29c-3pmimic或anti-miR-29c-3p处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，利用WesternBlot及qRT-PCR技术检测细胞内BACH2与ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出，了解过表达或沉默miR-29c-3p对BACH2、ABCA1表达以及细胞内胆固醇流出的影响。最后使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，采用qRT-PCR检测miR-29c-3p的表达，明确KAL对miR-29c-3p水平的影响，使用miR-29c-3pmimic和KAL共孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，通过qRT-PCR及WesternBlot检测BACH2和ABCA1的表达，并使用液体闪烁计数仪检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出。明确KAL是否通过miR-29c-3p靶向沉默BACH2，促进ABCA1表达BACH2影响ABCA1表达及胆固醇流出。
结果：KAL显著上调巨噬细胞ABCA1表达，并呈浓度和时间依赖性。KAL增加ABCA1介导的胆固醇流出，并减少细胞内总胆固醇、胆固醇酯(cholesteryl ester，CE)和游离胆固醇(free cholesterol，FC)含量，抑制脂质蓄积。
生物信息学预测发现，BACH2与ABCA1启动子存在结合位点。进一步通过荧光素酶报告基因和CHIP实验证实BACH2与ABCA1启动子具有结合位点，而过表达BACH2促进ABCA1表达，增加巨噬细胞的胆固醇流出，提示BACH2可与ABCA1结合并促进其转录。KAL处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后，BACH2及ABCA1的mRNA与蛋白水平明显增加，提示KAL可促进BACH2及ABCA1的表达与结合能力。而在siBACH2预处理后，KAL对促进ABCA1表达的作用被逆转，同样细胞内胆固醇流出的促进作用也被逆转。上述结果表明，KAL通过增加BACH2，使ABCA1表达上调，细胞内胆固醇流出增加。
多个生物信息学在线网站预测发现miR-29c-3p与BACH23’UTR存在结合位点，且结合自由能低(-23.6kcal/mol)，荧光素酶报告基因等实验进一步发现miR-29c-3p可直接作用于BACH2，抑制其表达，并显著减少ABCA1。而抑制miR-29c-3p后可增加BACH2及ABCA1的mRNA和蛋白水平，促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出增加。说明miR-29c-3p可抑制BACH2及ABCA1的表达，减少胆固醇流出。使用KAL孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后，发现KAL明显降低miR-29c-3p的表达。而使用KAL和miR-29c-3pmimic共孵育后，与miR-29c-3pmimic组相比较，降低的BACH2及ABCA1的mRNA和蛋白水平得到一定程度的恢复，减少的胆固醇流出情况也有一定的恢复。这些结果表明，KAL通过抑制miR-29c-3p增加BACH2、ABCA1的表达及胆固醇流出。
小结：KAL上调ABCA1表达，促进胆固醇流出，抑制巨噬细胞内脂质蓄积；KAL通过miR-29c-3p/BACH2途径增加巨噬细胞ABCA1表达。
第三章KAL对apoE-/-小鼠ABCA1及As斑块面积的影响
目的：观察KAL对apoE-/-小鼠miR-29c-3p、BACH2和ABCA1表达，血脂水平，RCT效率和As斑块面积的影响，从而在整体水平揭示KAL的抗As作用及分子机制。
方法：60只雄性apoE-/-小鼠高脂饮食喂养8周后随机分为3组：1、对照组(n=20)：腹腔内注射200μl生理盐水，每周两次；2、低剂量KAL组(n=20)：腹腔内注射KAL，每次0.5mg/kg，加入200μl生理盐水中注入，每周两次；3、高剂量KAL组(n=20)：KAL剂量为每次2mg/kg，余同低剂量组。共连续处理4周。B超检查小鼠主动脉及颈动脉斑块。酶氧化法检测血浆TG、TC、LDL-C、HDL-C含量以及肝肾功能。腹腔注射[3H]标记胆固醇的J774细胞，检测血浆、肝脏和粪便中的放射性活性，计算RCT效率。处死小鼠，分离主动脉弓，体视显微镜下观察斑块情况。取小鼠心脏和主动脉，油红O和HE染色检测小鼠主动脉窦及主动脉As斑块面积。qRT-PCR检测主动脉及腹腔巨噬细胞miR-29c-3p及BACH2、ABCA1的mRNA表达，WesternBlot和免疫组织化学检测主动脉及腹腔巨噬细胞BACH2、ABCA1蛋白表达。
结果：无论是低剂量还是高剂量的KAL均减少apoE-/-小鼠主动脉弓及主动脉窦处斑块面积，抑制主动脉壁及斑块内脂质沉积，增加斑块胶原含量。证实KAL在动物体内能抑制As病变的进展。
KAL降低apoE-/-小鼠主动脉组织中miR-29c-3p水平，升高主动脉组织及腹腔巨噬细胞中BACH2、ABCA1水平，增加血浆HDL-C水平，促进RCT。提示KAL在体内同样通过抑制miR-29c-3p表达，从而减少miR-29c-3p对BACH2的抑制，促进ABCA1的表达，增加胆固醇流出至HDL，促进RCT，最终抑制apoE-/-小鼠As病变的进展。
KAL对apoE-/-小鼠体重、肝肾功能及血浆TC、LDL-C、TG水平无明显影响。
小结：KAL上调apoE-/-小鼠ABCA1表达，升高血浆HDL-C水平，促进RCT，减轻As病变；KAL在apoE-/-小鼠中通过miR-29c-3p/BACH2途径增加ABCA1表达。